Nur77Nur77在不同发育阶段小鼠睾丸的表达及其功能*

谷亚龙张新东金保方**. 东南大学附属中大医院中西医结合男科（南京 0009）；. 南京大学附属鼓楼医院生殖中心

Nur77Nur77在不同发育阶段小鼠睾丸的表达及其功能*

谷亚龙1张新东2金保方1**
1. 东南大学附属中大医院中西医结合男科（南京 210009）；2. 南京大学附属鼓楼医院生殖中心

摘要目的 观察核受体Nur77在不同发育阶段小鼠睾丸的表达，并探讨其对睾酮合成的作用。方法 用1周龄的ICR雄性小鼠作为幼年期组（相当于人类幼年期，n=6），4周龄的ICR雄性小鼠作为性发育前组（相当于人类青春期前，n=6），12周龄的ICR雄性小鼠作为性成熟期组（相当于人类青壮年，n=6），12月龄的ICR雄性小鼠作为老年组（相当于人类中老年，n=6）。Real time PCR和Western Blot分别检测小鼠睾丸中Nur77 mRNA和蛋白水平表达。体外培养小鼠睾丸间质细胞系MLTC-1，Nur77干涉腺病毒（Ad-siNur77）及空载腺病毒（Ad-CMV）转染MLTC-1。放射免疫法检测MLTC-1细胞培养液上清的睾酮含量，Real time PCR和Western Blot检测StAR及HSD3B的表达。结果 Nur77的mRNA水平在青春期前表达量最高，蛋白水平则在性成熟期小鼠睾丸中最高；Nur77干涉后MLTC-1细胞的睾酮合成含量较未干涉组明显降低；Nur77干涉后MLTC-1细胞的StAR和HSD3B的表达较未干涉组明显降低。结论 Nur77在小鼠睾丸组织的表达随年龄变化而变化，这种变化对于维持小鼠体内的睾酮水平可能有重要意义。

关键词Nur77; 睾酮; 莱迪希细胞

Key woorrddss Nur77; Testosterone; Leydig cells

睾酮的合成是在下丘脑-垂体-性腺轴的调控下涉及到睾丸内多个转录因子参与的复杂过程。Leydig细胞是雄性体内睾酮合成的主要细胞，在Leydig细胞内睾酮合成的过程大致如下：在间质细胞刺激素（ICSH）的作用下，类固醇快速合成蛋白（StAR）被激活，胆固醇由线粒体外膜转运到线粒体内膜，然后在细胞色素胆固醇侧链裂解酶的作用下生成孕烯醇酮，孕烯醇酮在3β-羟类固醇脱氢酶（HSD3B）作用下转化为孕酮，孕酮在17a-羟化酶催化下转化为17a-羟孕酮，后者转化为雄烯二酮后合成为睾酮[1]。但是，睾酮合成所涉及到的转录调节因子的参与仍不清楚。

孤核受体Nur77是调控类固醇合成酶基因表达的主要转录因子之一。研究表明，LH能够上调Leydig细胞Nur77的表达[2]；雌二醇（E2）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等均是通过下调Nur77的表达，抑制Leydig细胞合成睾酮[3, 4]，而环境内分泌干扰物双酚A (Bisphenol A) 可通过上调Nur77，促进Leydig细胞合成睾酮[5]；这均提示Nur77是介导Leydig细胞合成睾酮的关键基因。但是，在睾丸中，Nur77是否能够促进Leydig细胞睾酮合成，仍不清楚。

在本研究中，我们检测不同年龄段小鼠睾丸组织中Nur77表达，并在体外细胞学实验中讨论其在睾酮生成方面的潜在功能，增加我们对Nur77在睾酮合成方面的认识。

材料和方法

一、实验材料

（一）动物与细胞

ICR雄性小鼠：1周龄（n=6）、4周龄（n=6）、2周龄（n=6）和12月龄（n=6）；饲养环境：湿度：50%～70%，温度20℃～22℃；光照周期12h/12h；充足食物和饮水。实验动物购自常州卡文斯实验动物有限公司，经南京中医药大学动物伦理学委员会批准后使用。

MLTC-1细胞购自上海细胞生命科学院，培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、5%

O2饱和湿度细胞培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

（二）试剂

1640培养液，胰蛋白酶，胎牛血清（FBS）均购自Gibco公司；Nur77、GAPDH引物由上海英俊公司合成；兔Nur77抗体，兔HSD3B抗体，鼠StAR抗体，鼠GAPDH抗体购自Abcam公司；HRP二抗购自Jackson公司；RNA反转录试剂和荧光定量PCR试剂均购自TaKaRa公司；Trizol购自Invitrogen公司；放免法测定试剂盒购自北方生物技术研究所；全蛋白提取试剂盒购自南京凯基公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司；AdsiNur77及Ad-CMV由上海吉凯生物有限公司制备扩增。

二、实验方法

（一）组织取材

实验中使用的1周龄ICR雄性小鼠，对应于人类的幼年期，作为性未发育组；4周龄的ICR雄性小鼠，对应于人类青春期前，作为性发育前组；12周龄ICR雄性小鼠，对应于人类青壮年，作为性发育成熟组；12个月的ICR雄性小鼠，对应于人类中老年男子，作为老年组。每只小鼠，脱颈处死，取双侧新鲜睾丸组织用冰盐水清洗，放入液氮中冻存，用于总蛋白和总RNA的提取。

（二）转染

用Ad- CMV（100MOL）和Ad-siNur77 （100MOL）配制细胞培养液，转染MLTC-1细胞。24h后换普通培养液继续培养24h，收集细胞，用于mRNA和蛋白的检测。

（三）睾酮测定

用Ad- CMV（100MOL）和Ad-siNur77 （100MOL）配制细胞培养液，转染MLTC-1细胞。24小时后换普通培养液继续培养24h，收集上清，用放射免疫法（RIA）检测睾酮含量（具体参照RIA试剂盒说明）。

（四）mRNA检测

用Trizol法萃取样品总RNA，提取的RNA用反转录试剂盒按20μL体系反转成cDNA，所有的RTPCR反应使用SYBR Green PCR试剂盒在StepOne PlusTM Real-Time PCR序列检测系统中进行，管家基因GAPDH作为内部参照。引物序列：Nur77，FP：5'-GAC CCC ACT ATT TGT CTT ATC CC-3'，RP：5'-CCC ATC TCA ACC TCT TGC TTT C-3'；StAR，FP：5'-CGG GTG GAT GGG TCA AGT TC-3'，RP：5'-GCA CTT CGT CCC CGT TCT C-3'；HSD3B：FP：5'-GTG GGG CTT CTG CCT TGA T-3'，RP：5'-GGT TTT CTG CTT GGC TTC CTC-3'；GAPDH：FP：5'-AGG TTG TCTCCT GCG ACT TCA-3'，RP：5'-GGG TGG TCCAGG GTT TCT TAC T-3'。Real-Time PCR反应条件：95 ℃预变性5min，40个循环：95 ℃ 30s，60 ℃ 1min。进行溶解曲线分析，确定产物是否单一，使用2-∆∆CT方法计算目标mRNA的相对丰度，数据以百分比表示。

（五）蛋白检测

蛋白裂解液充分裂解样品，12 000×g，4 ℃，15min收取上清，-70 ℃保存，用于Western印迹分析处理。使用时，BCA法测定蛋白浓度，每条泳道上样40μg，用10%SDS-PAGE分离，随后将其转移到硝酸纤维素膜上，用含有5%脱脂奶粉的TBST溶液封闭1h，将膜与一抗4 ℃孵育过夜，各个抗体浓度为兔抗小鼠Nur77（1:1000），兔抗小鼠HSD3B （1:1000），鼠抗小鼠StAR（1:1000）,鼠抗小鼠GAPDH（1:5000），一抗孵育完成后，TBST 37 ℃洗涤3次，每次10min，再用HRP标记的抗兔和抗鼠二抗（1:5000）37 ℃孵育1h，二抗孵育完成后TBST 37 ℃洗涤3次，随后曝光显影。以GAPDH作为内参校正上样误差。

三、统计学方法

SPSS 16.0软件进行统计学处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，单因素样本均数比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、不同发育阶段小鼠睾丸组织中Nur77 mRNA mRNA及蛋白的表达水平

Nur77 mRNA在1周龄小鼠（幼年期）睾丸组织中表达量极低，而在4周龄小鼠（青春前期）睾丸组织中表达量最高，与幼年组相比，青春前期组睾丸中表达量明显增加（P＜0.01），12周龄小鼠（青壮年期）及12月龄小鼠（中老年期）睾丸组织中表达量则逐渐降低。蛋白水平与mRNA水平并不完全同步，Nur77蛋白的表达量在1周龄小鼠（幼年期）睾丸组织中表达量最低，其后逐渐增加，到12周龄小鼠（青壮年期）Nur77蛋白在睾丸组织中的表达达到高峰，12个月龄小鼠（中老年期）Nur77蛋白又显著下降，见图1。

二、干涉Nur77Nur77下调了MLTC-1LTC-1细胞的睾酮合成

MLTC-1细胞在转染Ad-siNur77后，能降低睾酮的合成（图2A2A），转染Ad-siNur77后与转染Ad- CMV相比，细胞上清的睾酮含量有统计学意义（P＜0.05），见图2。

图1 不同发育阶段小鼠睾丸中Nur77Nur77的表达水平

三、干涉Nur77Nur77下调了MLTC-1LTC-1细胞内StARStAR和HSD3BHSD3B的表达

Real time PCR的结果显示，Ad-siNur77转染MLTC-1细胞后，能降低StAR、HSD3B mRNA的表达（图3A3A、图3B3B），转染Ad-siNur77后与转染Ad-CMV相比，StAR、HSD3B mRNA的表达有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

Western blot的结果显示，Ad-siNur77转染MLTC-1细胞后，能降低StAR、HSD3B 蛋白的表达（图3C3C、图3D3D），转染Ad-siNur77后与转染Ad-CMV相比，StAR、HSD3B 蛋白的表达有统计学意义（P＜0.05）。

讨 论

图2 Nur77阻断下调了MLLTTCC--11细胞的睾酮合成

图3 Nur777阻断下调了MLLTTCC--11细胞SSttAARR和HHSSDD33BB的表达

睾酮的合成是一个受多种酶促反应调节的反应过程，各种酶和调节因子的表达与睾丸的发育阶段有着密切的关系。胚胎儿初期就有睾酮的分泌，妊娠12周时达高峰，此后开始下降，出生时最低。紧接着又开始上升，出生2个月时达到一个较高的浓度，然后再次下降，维持静止的水平直至青春期，青春期时在黄体生成素（LH）的刺激下，睾酮水平不断上升，20～29岁时达最高峰值，以后随年龄增长又出现下降[6]。在本研究中，我们发现Nur77的表达与哺乳动物体内睾酮的含量变化趋同，表明Nur77可能与睾丸间质细胞合成睾酮相关。

Nur77是孤核受体家族的一员，是即早反应（early-response）基因的一种，作为转录调控因子，参与调控细胞的多种功能活动。在Leydig细胞中，Nur77受LH的刺激而表达增高，促进睾酮合成[2]；雌二醇（E2）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）等可以通过下调Nur77的表达，抑制Leydig细胞合成睾酮[3, 4]。这均提示Nur77是介导Leydig细胞合成睾酮的正向调节因子。我们的研究发现干涉MLTC-1细胞Nur77的表达，基础状态下的睾酮合成变少，提示Nur77是睾丸间质细胞基础状态下睾酮合成的关键因子。

在本研究中，我们还发现干涉Nur77下调了StAR 和HSD3B的表达。有研究表明，在StAR和HSD3B的启动子上存在Nur77的结合位点，Nur77单独或者同其他转录因子结合，增加StAR和HSD3B的表达[7, 8]。这很可能是Nur77调节睾丸间质细胞睾酮合成的分子机制。

在本研究中，我们观察了Nur77在不同年龄段小鼠体内的表达情况，体外细胞学实验确定了Nur77是睾酮合成的正向调节因子。然而，由于技术原因所限制，未能在动物体内研究Nur77与动物睾酮合成的关系，为本研究尚待完善之处。

参 考 文 献

1 Payne AH, Youngblood GL. Regulation of expression of steroidogenic enzymes in Leydig cells. Biol Reprod 1995; 52(2): 217-225

2 Song KH, Park JI, Lee MO, et al. LH induces orphan nuclear receptor Nur77 gene expression in testicular Leydig cells. Endocrinology 2001; 142(12): 5116-5123

3 Lee SY, Park E, Kim SC, et al. ERalpha/E2 signaling suppresses the expression of steroidogenic enzyme genes via cross-talk with orphan nuclear receptor Nur77 in the testes. Mol Cell Endocrinol 2012; 362(1-2): 91-103

4 Lee SY, Gong EY, Hong CY, et al. ROS inhibit the expression of testicular steroidogenic enzyme genes via the suppression of Nur77 transactivation. Free Radic Biol Med 2009; 47(11): 1591-1600

5 Song KH, Lee K, Choi HS. Endocrine disrupter bisphenol a induces orphan nuclear receptor Nur77 gene expression and steroidogenesis in mouse testicular Leydig cells. Endocrinology 2002; 143(6): 2208-2215

6 Lamberts SW, van den Beld AW, van der Lely AJ. The endocrinology of aging. Science 1997; 278(5337): 419-424

7 Martin LJ, Tremblay JJ. The human 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/Delta5-Delta4 isomerase type 2 promoter is a novel target for the immediate early orphan nuclear receptor Nur77 in steroidogenic cells. Endocrinology 2005; 146(2): 861-869

8 Martin LJ, Boucher N, Brousseau C, et al. The orphan nuclear receptor NUR77 regulates hormone-induced StAR transcription in Leydig cells through cooperation with Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase I. Mol Endocrinol 2008; 22(9): 2021-2037

（2015-01-15收稿）

doi:10.3969/j.issn.1008-0848.2015.04.002

中图分类号R 347.911

*基金项目资助: 南京中医药大学青年自然科学基金（12XZR13）; 国家自然科学基金青年基金（81302969）;国家自然科学基金（81273760）; 国家自然科学基金（81473678）

Expression and function of Nur77 in testes of mice at different developmental stages*

Gu Yalong1, Zhang Xindong2, Jin Baofang1**
1. Andrology Department of Integrative Medicine, Zhongda Hospital, Southeast University, Nanjing 210009, China;
2. Reproductive Medicine Center, Department of Obstetrics and Gynecology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing
University Medical School
Corresponding author: Jin Baofang, E-mail: hexiking@126.com

AbstractObjectivess To observe the expression of Nur77 in the testes of mice at different developmental stages, and discuss its potential function in regulating androgen production. Metthhooddss Total of 24 ICR male mice at different developmental stages (one week as the infancy group; 4 weeks as the prepubertal group; 12 weeks as the adult group; over 12 months as the ageing group) were used in this study. Expression of Nur77 was detected by Real time PCR and Western Blot respectively. Testosterone level in medium of MLTC-1 cells transfected with Ad-siNur77 or Ad-CMV was measured by radioimmunoassay, meanwhile the expression levels of StAR and HSD3B in the transfected cells were also evaluated by realtime PCR and western blot. Ressuullttss Expression of Nur77 mRNA in the prepubertal group was signifi cantly higher than that in the adult group, while expression of Nur77 protein in the adult group was at highest level among four groups. AdsiNur77 inhibited the testosterone synthesis of MLTC-1 cells compared with the control group. Ad-siNur77 repressed mRNA and protein expression of StAR and HSD3B. Conclussiioonn Nur77 protein expression in the testis tissue was correlated with the age of mice, which may be signifi cant for maintaining testosterone levels in mice.

**通讯作者, E-mail: hexiking@126.com