基于DNA条形码的一株硬皮马勃菌的鉴定

李芳

摘要：本研究通过基于DNA条形码的分子鉴定方法对广东省广州市白云山风景区一株马勃菌进行精准鉴定。以野外采集的子实体提取的基因组为模板，扩增ITS和EF1α片段，并进行测序及系统发育分析。获得了600 bp左右的ITS片段和500 bp左右的EF1α片段，经分子系统学分析表明该硬皮马勃菌为Scleroderma sinnamariense，从而对该真菌进行了基于DNA条形码的精准鉴定。

关键词：硬皮马勃菌；分子鉴定；DNA条形码；ITS；EF1α

中图分类号：S939.5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）11-2598-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.11.010

Identification of One Scleroderma sp. Strain Based on DNA Barcoding

LI Fang

（Department of Chemical Engineering， Binzhou University， Binzhou 256600， Shandong， China）

Abstract： The aim of this study is to identify a Scleroderma sp. using DNA barcoding. ITS and EF1α genes were PCR amplified and sequenced. Further，molecular phylogeny based on ITS and EF1α confirmed the genetic position of this fungus. About 600 bp of ITS fragment and about 500 bp of EF1α fragments were obtained. The molecular phylogenetic analysis indicated that the fungus was Scleroderma sinnamariense. The results provided an exact identification method for this macro-fungus by DNA barcoding.

Key words： Scleroderma； molecular identification； DNA barcoding； ITS； EF1α

硬皮马勃属真菌，广泛分布于世界各地，共有60余种，在中国较常见的有11种[1]。该属真菌含有甾体化合物、萜类化合物、小分子含氮化合物、多糖、蛋白质、肽类、生物碱以及多种氨基酸，无机盐和微量元素等，具有一定的药理作用和临床应用价值：抑菌、抗炎、止血、杀虫、抗肿瘤细胞等功效[2]。

DNA条形码（DNA barcoding）是一种基于DNA序列差异，快速、准确的物种鉴定方法[3]。目前硬皮马勃属真菌的鉴定主要依赖于形态学的鉴定，部分研究利用ITS对野外生境采集的子实体进行分子水平鉴定[4]。因此选取ITS、EF1α两个序列对从广东省广州市白云山风景区采集的一株硬皮马勃菌进行序列测定及系统发育分析，并对该属适合的DNA barcoding进行了探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料 供试硬皮马勃菌子实体于2013年5月采自广东省广州市白云山风景区，子实体标本编号为JZBHM008。

1.1.2 试剂 基因组DNA提取试剂盒DNeasy Plant Mini Kit和凝胶回收试剂盒QIAquick Gel Extraction Kit购自德国QIAgen公司；TaKaRa PCR Mix购自大连宝生物公司；琼脂糖和SYBR Safe DNA Gel Stain购自Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取 无菌解剖刀切除子实体表层，取内部少量组织于1.5 mL的离心管中，加入少量液氮，研磨棒研磨至粉末状后，利用Dneasy Plant mini Kit试剂盒（QIAgen，货号69104）说明书进行DNA的提取。

1.2.2 ITS-PCR扩增 选取ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）为引物[5]，以所提基因组DNA为模板进行PCR扩增：95 ℃ 5 min（预变性）；95 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃终延伸7 min；降至4 ℃结束。反应体系为50 μL。然后进行电泳检测。

1.2.3 EF1α-PCR扩增 选取EF595F（5′-CCGATCTTGTAGACGTCCTG-3′）/EF1160R（5′-CGTGACTTCATCAAGAACATG -3′）[6]为引物，以所提基因组DNA为模板进行PCR 扩增：95 ℃ 5 min（预变性）；95 ℃变性30 s，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，30个循环；72 ℃终延伸10 min；降至4 ℃结束。反应体系为50 μL。然后进行电泳检测。

1.2.4 PCR产物测序 将目的条带从琼脂糖凝胶上切出后利用Qiagen Gel extraction kit纯化后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司Bigdye法测序。测序结果经过DNAMAN5.2.9和Chromas Pro软件进行碱基修正与拼接，最终获得的ITS和EF1α序列提交到GenBank 核酸序列数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）。endprint

1.2.5 系统发育分析 扩增获得的序列经过NCBI网站BLAST比对后，选取近缘物种的ITS序列，利用MAGA6.0软件包[7]中MUSCLE工具进行比对，采用Kimura2-parameter模型[8]计算遗传距离，采用Neighbour-Joining方法[9]构建系统发育树，重复抽样1 000次分析系统发育树各分支的支持率。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

以子实体内部组织块为材料提取的基因组DNA为模板，PCR扩增获得600 bp左右的ITS片段和500 bp左右的EF1α片段（图1）。

2.2 序列测定

ITS和EF1α PCR产物经过纯化后测序，测序结果经过Chromas Pro软件进行碱基修正，修正后的序列经过DNAMAN5.2.9软件进行拼接，获得565 bp的ITS序列和537 bp的EF1α序列，GenBank登录号分别为KM048204和KM048205。

2.3 系统发育分析

将本研究获得ITS序列在NCBI网站上进行比对，选取近缘物种的ITS序列，构建系统发育树，结果如图2所示。由图2可知，Scleroderma sp. JZBHM008与S. sinnamariense CMU53-210-2和 S. sinnamariense SINSCL9的亲缘关系最近，同源性为100%（支持率为100%），说明本研究的菌株可能为S. sinnamariense。

EF1α系统发育分析结果表明，Scleroderma sp. JZBHM008与Scleroderma sp. JZBHM008与S. sinnamariense AWW254有92.8%的同源性（支持率为100%），与ITS的系统发育分析结果一致，进一步证实了JZBHM008为S. sinnamariense（图3）。

3 讨论

EF1α基因是编码延伸因子，能够与核糖体循环结合而把氨基酸加到多肽链上的蛋白质因子。EF1α基因是带有内含子的单拷贝基因[10]，一般第一、二密码子高度保守，但第三密码子替换常常达到饱和，因此是一个具有潜力的标记基因。本研究中EF1α的比对分析结果表明，仅含有197个可变位点和106个简约性信息位点（对构建系统发育树有贡献的位点），而ITS序列包含287个可变位点和148个简约性信息位点，具有更多的菌株差异，在分类鉴定中有更好的分辨率，因此ITS较EF1α更为适合作为Scleroderma属的核心DNA barcoding，EF1α可以作为辅助。

参考文献：

[1] 陈 丽，李晓明，张鞍灵，等. 黄硬皮马勃提取物抑菌活性初步研究[J].西北农业学报，2006，15（3）：87-90.

[2] 赵会珍，胥艳艳，付晓燕，等.马勃的食药用价值及其研究进展[J].微生物学通报，2007，34（2）：367-369.

[3] SCHOCH C L， SEIFERT K A，HUHNDORF S， et al. Nuclear ribosomal internal transcribed spacer（ITS） region as a universal DNA barcode marker for Fungi[J]. Proc Natl Acad Sci U S A， 2012， 109（16）：6241-6246.

[4] 张国广，刘振富，张 颖，等. 野生小马勃的鉴定及其生物学特性研究[J].中国食用菌，2009，28（6）：30-31，59.

[5] WHITE T J，BRUNS T，LEE S，et al. Amplification and Direct Sequencing of Fungal Ribosomal RNA Genes for Phylogenetics. PCR Protocols： A Guide to Methods and Applications[M]. New York： Academic Press， 1990.

[6] ESTRADA A E R， JINENEZ-GASCO M D M， ROYSE D J. Pleurotus eryngii species complex：Sequence analysis and phylogeny based on partial EF1α and RPB2 genes[J]. Fungal Biology，2010， 114：421-428.

[7] TAMURA K， STECHET G， PETERSON D， et al. MEGA6： Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution，2013，30：2725-2729.

[8] KIMURA M. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences[J]. Journal of Molecular Evolution，1980，16：111-120.

[9] SAITOU N， NEI M. The neighbor-joining method：A new method for reconstructing phylogenetic trees[J]. Mol Biol Evol，1987，4： 406-425.

[10] NORMARK B B. Evolution in a putatively ancient asexual aphid lineage：Recombinat ion and rapid karyotype change[J]. Evolution，1999，53（5）：1458-1469.endprint