人前列腺癌细胞系PC-3再表达雄激素受体（AR）的肿瘤生物学特性研究及其意义*

刘 欣 曹靖晨 王海燕 鄂 群，张 冲 张永辉 陈苗苗 顾 晓 江 明**

1. 江苏省靖江市人民医院泌尿外科（靖江 214500）； 2. 江苏省苏北人民医院泌尿外科；3. 南通大学医学院基础医学研究室核受体与肿瘤研究实验室； 4. 南通大学医学院病理学系

·论 著·

人前列腺癌细胞系PC-3再表达雄激素受体（AR）的肿瘤生物学特性研究及其意义*

刘 欣1，2△曹靖晨3△王海燕3鄂 群3，4张 冲3张永辉3陈苗苗3顾 晓2**江 明3**

1. 江苏省靖江市人民医院泌尿外科（靖江 214500）； 2. 江苏省苏北人民医院泌尿外科；3. 南通大学医学院基础医学研究室核受体与肿瘤研究实验室； 4. 南通大学医学院病理学系

目的 研究人全长雄激素受体（androgen receptor， AR） cDNA质粒（pSAR-IRES-EGFP）在人进展期前列腺癌细胞系PC-3中稳转染再表达，即人前列腺癌细胞系PC-3-AR+的肿瘤生物学特性及其干细胞相关基因蛋白表达的变化，探讨AR的分子生物学作用。方法 （1）应用体外细胞培养，通过四氮甲基唑氮（MTT）和细胞划痕等方法检测癌细胞生长和迁移特性；Western Blot方法检测干细胞相关蛋白的表达；细胞爬片和免疫荧光方法检测干细胞相关蛋白的定位和表达。（2）应用人前列腺癌细胞组织重组-先天免疫缺陷小鼠（Nude）肾包膜下移植技术，建立人前列腺癌-小鼠移植瘤模型，通过H.E.染色和病理学分析研究癌细胞的成瘤性、浸润和转移能力等肿瘤生物学特性；通过免疫组化染色技术检测移植瘤干细胞相关蛋白的定位和表达。结果 人雄激素非依赖型进展期前列腺癌细胞系PC-3再表达全长AR cDNA，即PC-3-AR+，导致以下情况的改变：（1）体外细胞培养中癌细胞的生长和扩增能力以及迁移特性均受抑制；（2）小鼠体内移植瘤肿瘤体积减小，癌细胞变大，分化增强，坏死增加和浸润能力减低；（3）培养细胞中检测到干细胞相关蛋白CD133、CD44和ALDH等的表达增加。结论 人雄激素非依赖型前列腺癌细胞系PC-3再表达全长AR cDNA，使其生长受抑，分化增强，坏死增加和干细胞相关基因蛋白（CD133、CD44和ALDH）的表达增加。

前列腺肿瘤； 细胞系， 肿瘤； 受体， 雄激素； 干细胞相关基因

前列腺癌（prostate cancer， PCa）是男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，其致死率在美国仅次于肺癌［1］。近年来，在中国前列腺癌的发病率逐年升高［2］。由于人群缺少前列腺特异性抗原（PSA）的筛查，中国初诊前列腺癌患者在就诊时病灶多已进展，甚至发生远处转移，因此，前列腺癌在中国人群中的发生、发展的分子机制和临床早诊早治的研究已引起人们的高度重视。

目前，前列腺癌的发病原因和发病机制尚不清楚，前列腺癌的发生与男性睾丸和雄激素（androgens）有着密切的关系。雄激素与核受体雄激素受体（androgen receptor，AR）结合，促使AR的反式激活，AR发生构相改变，形成二聚体与DNA上的雄激素反应元件（ARE）结合，后与共调节蛋白（共激活物或共抑制物）结合，作用于靶基因的增强子，促进靶基因的转录，引发一系列蛋白的表达，从而引起PSA表达增高，促进细胞增殖和抑制细胞凋亡等［3］。

近年来的研究发现，肿瘤内存在少数类似于干细胞的肿瘤细胞，称为肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC），这是一类具有自我更新、无限增殖和多向分化潜能的细胞［4，5］。有研究指出，在极少量肿瘤干细胞高度扩增和分化能力作用下，即可复制原有肿瘤的异质性表型，使实体肿瘤进一步增大及转移［6-8］。由于肿瘤干细胞具有自我更新及耐药能力，被认为是肿瘤进展、转移及肿瘤复发的重要因素，因此，传统的肿瘤治疗方案只能消灭大量的肿瘤细胞，而未能将CSC完全清除［7，9］。研究表明，前列腺癌细胞亦有向肿瘤干细胞转化或逆分化的倾向，从而使癌细胞的恶性程度增高，进而向周围组织脏器转移［6］。前列腺组织正常干细胞和肿瘤干细胞表达不同程度的干细胞相关基因（stemness-related gene），如CD133、CD44和ALDH1等［10，11］，其可用于检测前列腺癌干细胞的生物学特性的标记物。

本研究旨在应用体外细胞培养和体内人前列腺癌-小鼠移植瘤模型，研究人全长雄激素受体AR cDNA再表达人前列腺癌细胞PC-3-AR+与AR阴性PC-3细胞的肿瘤生物学特性的异同，从干细胞相关基因表达水平的变化，探讨前列腺癌雄激素依赖性转化的分子机制，为临床预防和靶向治疗雄激素非依赖性前列腺癌（androgen-independent prostate cancer，AIPC）提供前期实验资料。

材料和方法

一、实验材料

（一）细胞系

人进展期前列腺癌细胞系PC-3购自美国ATCC，该细胞系不具有可检测的雄激素敏感性，为雄激素非依赖型细胞。人雄激素受体（AR）全长cDNA质粒（pSAR-IRES-EGFP）的构建和其稳转染建立的AR再表达人前列腺癌细胞系PC-3-AR+ ，由美国John Hopkins大学医学院John T. Isaacs教授赠送［12］。

（二）主要试剂

RPMI-1640培养基、0.25%胰酶消化液、双抗，美国Hyclone公司；胎牛血清，美国Gibco公司；四氮甲基唑蓝、DMSO，上海生工生物工程有限公司；蛋白裂解液、上样缓冲液、脱脂奶粉，碧云天生物技术有限公司；AR抗体（sc-816）、CD44抗体（HCAM，sc-7297），美国Santa Cruz公司；CD133抗体（Anti-PROM1，SAB2107606）、β-actin抗体（A5316），美国Sigma-Aldrich公司；Anti-ALDH （ALDH1A1）抗体（611194），美国BD Transduction Laboratories公司；DAB显色试剂盒，中杉金桥生物技术有限公司；ECL化学发光显影剂，美国Thermo Pierce公司。

（三）小鼠

先天免疫缺陷BALB/C裸鼠，SPF级，8周龄，购自上海斯莱克动物公司。

二、仪器

CO2培养箱（美国Thermo Fisher），酶标仪（瑞士TECAN，M200），体视显微镜（德国Zeiss，Stemi DV4），倒置相差显微镜（德国Leica），正置荧光显微镜（德国Leica），电泳仪（美国Bio-Rad，PowerPac Basic），化学发光成像系统（美国Bio-Rad，ChemiDoc XRS+），小动物活体分子影像成像系统（美国UVP，iBox Explorer）。

三、实验方法

（一）细胞培养

人进展期前列腺癌细胞系PC-3和PC-3-AR+用含5%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养液于37℃、5% CO2、饱和湿度恒温培养箱培养，0.25%胰酶消化传代。

（二）生长曲线实验

PC-3-AR+（AR阳性）细胞和对照PC-3（AR阴性）细胞，经消化后计数，以4000/孔的密度接种至96孔板，每孔200μL，设5个复孔。各分两组培养，一组用完全培养液，一组用雄激素浓度为1×10-6mol/L的培养液。培养1d，3d，5d，7d后加入5%四氮甲基唑蓝（MTT）溶液20μL，继续培养4h，后吸去上清，每孔加入DMSO溶液150μL，室温摇床溶解10min，酶标仪检测490nm处OD值。绘制生长曲线。

（三）细胞划痕实验

将PC-3-AR+细胞和PC-3细胞分别接种于6孔培养板，待细胞贴壁且融合后划痕，用PBS洗掉漂浮细胞，加低血清培养基继续培养，放入培养箱，按时取样，拍照。观察细胞向无细胞划痕区迁移的情况。

（四）Western Blot

用蛋白裂解液（RIPA裂解液：PMSF=100：1）收集PC-3-AR+细胞和PC-3细胞蛋白样品，为确保蛋白上样量一致，经BCA蛋白定量法调整蛋白浓度为2μg/μL。在蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，沸水浴5min。配制10%SDS-PAGE凝胶，按每孔50μg/25μL上样，进行蛋白恒压电泳，浓缩胶电压80V，分离胶电压100V。电泳结束后，PVDF膜恒流转膜，260mA，2h。取出PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭2h。孵育一抗，4℃，过夜。洗膜后加入二抗（HRP标记）。ECL显影剂显影。

（五）细胞免疫荧光

将PC-3-AR+细胞和PC-3细胞分别接种于经多聚赖氨酸包被盖玻片的24孔培育板内，细胞长满至60%时，弃培养液，4%多聚甲醛固定30min，0.2%Triton X-100破膜5min，5% 小牛血清封闭 30min，一抗 4℃孵育过夜，荧光标记二抗室温孵育2h， 每个步骤间均用0. 01 mol/L PBS 冲洗3遍。甘油封片后置倒置荧光显微镜下观察。

（六）人前列腺癌细胞组织重组-移植小鼠模型

1. 组织重组块的制备：将鼠尾提取的胶原蛋白（浓度为10 g/L）与工作液以2：1的比例混匀，置于冰上，加入相当数量GFP标记的前列腺癌细胞PC-3和PC-3-AR+，使最终每个组织重组块含有2×105个细胞，吸取50μL胶原蛋白混合液滴加在无菌培养皿中，放于37℃培养箱中凝固30 min，待组织块呈固状后，加入少量RPMI-1640完全培养液，使培养液完全没过组织块，置于37℃和5% CO2培养箱中培养，备用。

2. 在无菌条件下，将组织重组块接种于BALB/C裸鼠（Nude）的肾包膜下，缝合后，待老鼠完全苏醒后置于屏障系统中饲养。

3. 小动物分子影像仪下观察肿瘤状况，记录肿瘤大小。在8周和12周取带有肿瘤组织的小鼠肾脏，浸泡于10%福尔马林固定液中，留待做病理切片。

（七）病理切片和诊断

取带有肿瘤组织的小鼠肾脏，置于10%福尔马林固定液中浸泡固定24h，梯度酒精脱水透明，石蜡包埋，制备切片，常规HE染色，中性树胶封片。光镜下进行形态学观察。

（八）免疫组织化学染色

取未HE染色的石蜡切片，脱蜡、水化，PBS冲洗，H2O2孵育5min，PBS冲洗，抗原修复，PBS冲洗，滴加山羊血清封闭10min，PBS冲洗，一抗4℃孵育过夜，PBS冲洗，二抗室温孵育1h，PBS冲洗，DAB显色，冲洗后苏木素复染，盐酸酒精分化，自来水冲洗，脱水、透明、封片。光镜下观察。

结 果

图1 PC-3-AR细胞的鉴定AR为高表达，定位于细胞核

细胞培养中，我们发现PC-3-AR+细胞较PC-3细胞的黏附性更强，不易用胰蛋白酶消化传代；应用MTT法检测两种细胞系增殖能力的差异（图2），结果显示，AR再表达人前列腺癌PC-3-AR+细胞相比于AR阴性（雄激素非依赖型）PC-3细胞，其增殖速度明显减慢，生长扩增能力减弱，而且对雄激素有明显反应。通过细胞划痕法检测两种细胞系迁移能力的差异（图3），结果显示，AR的过表达，能抑制细胞迁移。

应用Western Blot方法，分别检测PC-3-AR+和 PC-3细胞系中干细胞相关基因及CD133、CD44和ALDH1等表达情况（图4）。AR在前列腺癌PC-3细胞中再表达，使得CD133、CD44和ALDH等干细胞相关基因蛋白的表达增高。

建立人前列腺癌细胞组织重组-移植先天免疫缺陷Nude小鼠模型（图5），检测转染荧光蛋白GFP标记的PC-3-AR+的成瘤性及其肿瘤病理生物学特性，小鼠毛发呈非特异性背景色（图6）。小动物分子影像系统图片（图6A）显示，在手术8周后，PC-3细胞形成的肿瘤体积要明显大于PC-3-AR+细胞。HE染色结果（图6B）显示，PC-3肿瘤组织中，癌细胞体积较小，核染色深，分化程度差，细胞排列紊乱，可见明显癌细胞浸润至Nude小鼠肾脏组织；而PC-3-AR+肿瘤组织，癌细胞体积较大，部分核呈空泡状，可见明显坏死区，癌细胞浸润能力相对较差。

图2 AR再表达对前列腺癌细胞增殖能力的影响A 未添加雄激素 B 添加雄激素

图3 AR再表达对前列腺癌细胞迁移能力的影响

图4 PC-3-AR 细胞干细胞相关基因蛋白CD133、CD44和ALDH1的表达

图5 人前列腺癌细胞组织重组-移植Nude小鼠模型手术过程

移植瘤的免疫组化染色结果：细胞来源鉴定GFP和AR以及干细胞相关蛋白CD44的表达（图7）。GFP在PC-3和PC-3-AR+移植瘤中均为只在瘤体部分阳性表达，AR在PC-3-AR+移植瘤中阳性表达，CD44在PC-3-AR+移植瘤中比在PC-3中表达增强。

图6 雄激素受体再表达对人前列腺癌移植瘤的影响A： 用小动物分子影像仪拍摄的小鼠移植瘤模型， 腹部图（小鼠毛发非特异性背景色）和肾脏移植瘤图（手术后8周）； B： 肿瘤组织病理形态学观察（左HE×50，右HE×200）

图7 人前列腺癌细胞组织重组-移植瘤免疫组化结果

讨 论

目前，前列腺癌的发病原因与发病机制尚不清楚，前列腺癌的高发人群集中在老年人，年龄越大发病率越高，青年人几乎不发病，中年人发病少见。有研究发现，睾丸不发育或没有睾丸的人不发生前列腺肥大，也不发生前列腺癌，说明前列腺癌的发生与男性睾丸和雄激素（androgens）有着密切的关系。雄激素是一类甾体类激素，在正常男性生殖系统的发育过程中起着关键性的作用。雄激素在血液中最主要的形式是睾酮，睾酮进入前列腺后，90%以上的睾酮转化为双氢睾酮（dihydrotestosterone，DHT），DHT的亲活力比睾酮大5倍。雄激素与核受体AR结合，促使AR的反式激活，AR发生构相改变，形成二聚体与DNA上的雄激素反应元件（ARE）结合，后与共调节蛋白（共激活物或共抑制物）结合，作用于靶基因的增强子、促进靶基因的转录，引发一系列蛋白的表达，从而引起PSA表达增高，促进细胞增殖和抑制细胞凋亡等［3］。目前，根据雄激素在前列腺癌发生发展中的特殊机制，去除雄激素或拮抗雄激素的内分泌治疗已成为前列腺癌的重要治疗手段之一。但一般经12～18个月的治疗后，患者对内分泌治疗的敏感性降低，即雄激素依赖性前列腺癌（androgen-dependent prostate cancer，ADPC）转变为AIPC［13］，预后较差。Labrie等［14］报道称去势手术后，前列腺癌患者外周血睾酮含量降低了95%，然而前列腺组织中的DHT却只降低了60%。Montgomery等［15-17］进而发现，AIPC患者肿瘤组织中的雄激素浓度是未进行去雄激素治疗的前列腺癌组织中的3.8倍，与此同时，参与雄激素代谢的相关基因水平也明显增加。结果表明，在去除雄激素治疗的选择性压力下，前列腺癌组织能够通过促进癌组织中局部雄激素生成这样一种“逃逸机制”来对抗血液循环中雄激素的下降，但具体机制不详。AIPC目前尚无有效的治疗方案，因此，为阻止或延缓前列腺癌向失控性雄激素非依赖性发展，研究AIPC的发生机制，即雄激素依赖性向雄激素非依赖性转变的分子机制，也就成为目前前列腺癌研究的热点。

PC-3细胞为雄激素非依赖型人进展期前列腺癌细胞系，AR表达阴性，是对比性研究前列腺癌雄激素依赖性或非依赖性分子机制很好的模型［18］。有报道［12］PC-3-AR+细胞系为John T. Isaacs教授领导的实验室应用人全长AR cDNA质粒转染PC-3细胞而建立，AR表达为强阳性，应用雄激素诱导可部分恢复雄激素依赖性。我们应用PC-3-AR+和PC-3两株细胞系，对比性研究AR对人前列腺癌细胞的肿瘤生物学特性和干细胞相关基因表达的影响。

在体外培养中我们发现，AR再表达对于人前列腺癌细胞的肿瘤生物学特性有明显的改变，PC-3-AR+细胞较PC-3细胞的黏附性更强，难用胰酶消化下来，生长速度较慢。通过MTT和细胞划痕实验证明，AR再表达可以使得人前列腺癌细胞的生长能力减弱，细胞增殖和迁移受抑制。

继之，我们建立了人前列腺癌细胞组织重组-移植小鼠模型，比较PC-3-AR+与PC-3细胞在体内移植瘤的肿瘤生物学特点的异同。PC-3细胞的成瘤率、成瘤体积均大于PC-3-AR+细胞，虽然两株细胞系均未发见明显转移，但PC-3移植瘤癌细胞可向宿主Nude小鼠肾脏组织内明显浸润，且癌细胞体积较小，部分分化差，细胞排列紊乱，恶性程度较高。在两株细胞的体内和体外实验中，PC-3细胞都比PC-3-AR+细胞表现得更具有低分化癌细胞的特性，生长快，迁移能力强，体内恶性程度高。

我们的Western Blot结果显示，PC-3中的干细胞相关基因 （包括CD44、CD133和ALDH）的表达均低于PC-3-AR+细胞。据报道，在PC-3细胞培养形成的全克隆和类干细胞球中没有检测到比母细胞PC-3更丰富的所谓肿瘤干细胞表面标记物［19］。虽然，CD133、CD44和ALDH1一直以来被作为肿瘤干细胞相关基因，但也有研究表明，CD44表达增高具有抗癌作用，CD44丢失可能有利于肿瘤侵袭［20］；应用磁珠分选得到的CD44+/CD133+亚型细胞的生长速率反而慢于PC-3细胞［21］；应用ChIP技术，发现在CD44和CD133基因的启动子中存在AR结合位点（ARE），AR与CD44和CD133基因可能存在正向调节关系［20］。基于以上实验结果，我们认为AR基因与正常和肿瘤干、祖细胞的分化程度、干细胞相关基因表达谱和细胞生物学特性之间的关系有待进一步研究。

我们将建立新的人前列腺癌体外和体内转化医学研究模型，应用先进的基因芯片和PCR芯片等高通量基因检测技术，研究正常和肿瘤干、祖细胞及相互演变过程中干细胞相关基因表达谱的变化及其与细胞生物学和肿瘤生物学特性的关系，为临床预防和有效治疗AIPC提供理论基础。

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（2015-05-28收稿）

Biological behaviors of human prostate cancer cells PC-3-AR+with androgen receptor （AR）-overexpressed and its signi cance

Liu Xin1，2△， Cao Jingchen3△， Wang Haiyang3， E Qun3，4，
Zhang Chong3， Zhang Yonghui3， Chen Miaomiao3， Gu Xiao2**， Jiang Ming3**
1. Department of Urology， Jingjiang People's Hospital， Jingjiang 214500， Jiangsu， China；2. Department of Urology， Subei People's Hospital of Jiangsu Province； 3. Laboratory of Nuclear Receptors and Cancer Research， Center for Basic Medical Research， Nantong University School of Medicine； 4. Department of Pathology， Nantong
University School of Medicine
Corresponding： Gu Xiao， E-mail： guxiao222@hotmail.com； Jiang Ming， E-mail： ming.jiang@ntu.edu.cn

Objective To investigate the changes of biological behaviors and stemness-related gene expression levels in human prostate cancer cells PC-3-AR+with androgen receptor （AR）-overexpressed and discuss its possible function.Methods （1） Cancer cell growth and migration were respectively measured by MTT assay and wound healing assay. The expressions of stemness-related proteins were detected by Western blot. The expression pattern and localization of stemness-related proteins were detected by cell immuno uerescence staining. （2） The human prostate cancer xenografting mouse models were established to detect the expression pattern and localization of stemness-related proteins and analyze histopathological changes. The models were established by implanting the tissue recombinants into the sub-renal capsule of severe combined immunode cient （Nude） mice. Results Overexpression of full-length androgen receptor （AR） in human prostate cancer cell line PC-3-AR+ could lead to the following results. （1） The characteristics of cell growth and migration were inhibited； （2） The differentiation ability of xenografted cancer cells was increased， the tumor size and invasion ability were decreased. （3） The expression levels of stemness-related proteins， such as CD133， CD44 and ALDH， were enhanced. Conclusion The overexpression of full-length AR cDNA in human prostate cancer cells may result in the changes of cancer biological behaviors and stemness-related proteins expression.

prostatic neoplasms； Cell Line， Tumor； receptors， androgen； stemness-related genes

10.3969/j.issn.1008-0848.2015.07.002

R 737.25

资助： 本研究课题受国家自然科学基金（NSFC）面上项目（项目批准号：81372772）；

江苏特聘教授科研基金（苏教师【2012】34号）

**通讯作者， 顾晓， E-mail： guxiao222@hotmail.com； 江明， E-mail： ming.jiang@ntu.edu.cn

△为并列第一作者