青兰属植物甘青青兰化学成分研究

左马怡，杨 超，田 倩，罗 阳，杨 淬，曾 亮，李干鹏

(云南民族大学民族药资源化学国家民委－教育部重点实验室，云南昆明650500)

甘青青兰(Dococe Phalumtanguticum Maxim.)系唇形科(Labiatae)青兰属(Dracocephalum)多年蔓生草本植物［1］，别名唐古特青兰、陇塞青兰，藏名译音:知羊故、知羊高.甘青青兰是一种传统中药，其性寒，味甘、苦，具有香味;有和胃疏肝、清热利水、止咳化痰等功能，是藏医常用唇形科草本植物药材，一般用其的地上干燥部分入药，可治创伤、溃疡、头晕、胃炎、关节炎和肝炎等症［2］.其常生长于海拔1 900～4 600 m的地方，在干燥河谷的谷岸、山野路旁、草滩或高山草地、田边及松林边缘生长.主要分布于西藏(东部)、青海(东南部)、甘肃(西南部)以及四川(西部)等地［3］.

青兰属植物化学成分复杂，主要可分为挥发油类、黄酮及黄酮苷类、植物甾醇类、有机酸及其酯类、无机元素等，国内外研究报道多为黄酮类化合物，也有二萜、三萜等［4］;为了更好地开发利用这一药用植物资源，搞清甘青青兰的药效物质基础，对甘青青兰乙醇提取液的化学成分进行研究，并对其中部分化合物做抗肿瘤活性测定;以期对今后甘青青兰的药理研究、临床应用，以及藏药的新药研发提供有效的科学依据.

1 实验部分

1.1 实验药材、主要试剂与仪器

仪器:核磁共振谱仪AVANCEⅢ(瑞士BRUKER公司);旋转蒸发仪N－1100D－WD(上海EYELA仪器有限公司);暗箱式紫外分析仪ZF－20D(巩义市予华仪器有限公司);红外分光光度计Nicoiet Is10(美国赛默飞世尔科技有限公司;高效液相色谱仪安捷伦1200(美国安捷伦公司).

试剂:甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇等有机试剂均为分析纯，水为纯净水.

药材:甘青青兰全草于2013年8月购于云南省迪庆自治州藏医院，植物标本经藏医阿荣鉴定.

1.2 提取与分离

将采集的甘青青兰全草7.8 kg，经粉碎机粉碎(过0.216nm筛)，用95%的乙醇浸泡在25 L的渗漉桶中，冷提4次，每次5～7滴.提取液过滤、在56℃水浴下用旋转蒸发仪将提取液减压浓缩，回收溶剂，然后水浴挥干，得总浸膏约780 g.将适量温水加入所得浸膏中使其溶解，分别用乙酸乙酯、正丁醇于室温下连续萃取4次，将不同萃取液分别合并，用旋转蒸发仪减压浓缩，依次制得甘青青兰不同极性部位萃取物:乙酸乙酯部分浸膏约72 g、正丁醇部分浸膏约123 g、水相部分浸膏206 g.将乙酸乙酯部位上硅胶柱层析，用氯仿/甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集各组分，再经反复柱色谱分离、纯化，得到化合物1(7.1 mg)、化合物2(22.8 mg)、化合物3(5.8 mg)、化合物4(11.7 mg)、化合物5(7.9 mg)、化合物6(7.2 mg).

2 结果与讨论

2.1 结构鉴定

化合物1 分子式为C18H16O8;深褐色粉末，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.27(1H，d，J=1.6 Hz，H －2)，7.07(1H，d，J=7.9 Hz，H －5)，7.02(1H，dd，J=1.9，8.0 Hz，H －6)，7.77(1H，d，J=16.0 Hz，H － 7)，6.49(1H，d，J=15.6 Hz，H － 8)，6.13(1H，d，J=4.0 Hz，H －2.)，6.88(1H，d，J=8.4 Hz，H－5')，3.57(2H，m，H －7')，5.49(m，H －8');13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:127.1(C －1)，114.0(C －2)，146.2(C －3)，147.7(C －4)，116.4(C －5)，123.2(C －6)，147.7(C －7)，116.4(C －8)，168.5(C －9)，129.0(C －1')，117.5(C －2')，146.2(C －3')，144.8(C －4')，116.2(C －5')，121.8(C －6')，37.5(C －7')，74.4(C－8').以上数据与文献［5］报道一致，化合物1鉴定为迷迭香酸.

化合物2 分子式为C19H18O8;黄色粉末，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.05(1H，d，J=2.0 Hz，H －2)，6.58(1H，d，J=1.6 Hz，H －5)，6.80(1H，dd，J=4.4，8.0 Hz，H － 6)，7.57(1H，d，J=16.0 Hz，H －7)，6.28(1H，d，J=14.6 Hz，H － 8)，6.95(1H，d，J=1.6 Hz，H －2')，6.72(1H，d，J=2.0 Hz，H －5')，3.04(2H，m，H －7')，5.21(1H，dd，J=5.2 Hz，11.6，H － 8');13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:127.5(C －1)，114.0(C －2)，146.6(C －3)，147.9(C －4)，116.2(C －5)，123.2(C －6)，147.9(C －7)，116.4(C －8)，168.3(C －9)，128.7(C －1')，117.1(C －2')，146.6(C －3')，145.2(C －4')，117.5(C －5')，120.8(C －6')，37.7(C －7')，74.8(C－8')，52.6(－OCH3).以上数据与文献［5］报道一致，化合物2鉴定为迷迭香酸甲酯.

化合物3 分子式为C10H11O5;黄色粒状，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:6.67(1H，d，J=9.6 Hz，H －5)，6.53(s，br，H －6)，7.91(1H，d，J=6.4 Hz，H －8)，3.34(3H，s，－ COOCH3);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:129.7(C －1)，117.5(C －2)，145.0(C －3)，146.0(C －4)，116.1(C －5)，121.7(C －6)，73.3(C －8)，175.8(C －9).以上数据与文献［6］报道一致，化合物3鉴定为2，3－2H－3－羟基－咖啡酸甲酯.

化合物4 分子式为C9H8O4;黄色结晶，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:6.93(1H，d，J=8.0 Hz H －2)，6.78(1H，d，J=2.4 Hz H －5)，7.55(1H，d，J=2.4 Hz，H － 7)，6.23(1H，J=2.4 Hz，H －8);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:127.7(C －1)，115.1(C －2)，146.7(C －3)，147.0(C －4)，116.4(C －5)，122.8(C －6)，147.0(C －7)，115.5(C－8)，171.0(C－9).以上数据与文献［6］报道一致，化合物4鉴定为咖啡酸.

化合物5 分子式为C7H6O3;白色针状结晶，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.88(2H，dd，J=8.0 Hz，2 －H，6 －H)，6.81(2H，m，3 －H，5 －H);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:132.9(C －1)，133.2(C －2，C －6)，114.2(C －3，C －5)，163.1(C－4)，170.1(C －7).以上数据与文献［7］报道一致，化合物5鉴定为对羟基苯甲酸.

化合物6 分子式为C7H6O4;黄色片状，溶于甲醇;1H NMR(CD3OD，400 MHz)δ:7.41(1H，d，J=0.8 Hz，H －2)，6.76(1H，d，J=8.0 Hz，H －5)，7.44(s，br，H － 6)，6.23(1H，J=2.4 Hz，H － 8);13C NMR(CD3OD，100 MHz)δ:122.1(C －1)，114.4(C －2)，144.3(C －3)，147.0(C －4)，116.4(C －5)，122.6(C －6)，171.2(C －7).以上数据与文献［8］报道一致，化合物6鉴定为原茶酸.

2.2 抗肿瘤活性测定

将对数生长期的肿瘤细胞Hep G2、Hela、肺癌细胞株用0.25% 胰蛋白酶消化，然后用含10%胎牛血清，1%青链霉素的DMEM完全培养液吹打制成细胞悬液，分别将肿瘤细胞稀释至5.0×10－4mg/mL，再将其接种至96孔培养板中，每孔加入198 μL肿瘤细胞悬液，于37℃、5%CO2的培养箱内培养24 h.待细胞完全贴壁后，各实验组每 孔 加 入 含 不同 浓 度(10－4、10－5、10－6、10－7mmol·L－1)待测化合物 2 μL.阴性对照组加入含等体积药物溶剂的DMEM培养液200 μL.另单设不含细胞的DMEM培养液200 μL为空白对照组.阳性对照组采用以上相同浓度和体积的 DDP.每一个浓度设3个平行孔，培养24 h后各孔分别加入5 mg/mL的 MTT溶液20 μL，再培养4 h后，吸去各孔培养液，分别加入100μL DMSO，震荡20 min后用酶标仪在570 nm波长处测定各孔吸收度(OD)值.用以下公式计算药物各个质量浓度对肿瘤细胞的抑制率:

抑制率(%)=［1－(OD实验 －OD空白)/(OD对照－OD空白)］×100%

以同一药物的不同浓度对肿瘤细胞生长抑制率作图，可得到剂量反应曲线，根据线性回归方程求出该药物对细胞生长抑制率(IC50).

实验对分离提取的单体化合物1、2、3进行了体外抗肿瘤活性测定，结果表明3个化合物对Hep G－2、Hela、肺癌细胞株均有一定的抗肿瘤活性.化合物1对Hela细胞株具有较好体外抗肿瘤活性.化合物3对Hep G－2和肺癌细胞株具有较好的抗肿瘤活性.

表1 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ对Hela，Hep G－2、肺癌细胞株的IC50 μmol·L－1

3 结语

从甘青青兰乙酸乙酯部位中分离得到6个化学物.通过现代波谱技术对它们进行结构鉴定，6个化合物分别为迷迭香酸(1)，迷迭香酸甲酯(2)，2，3－2H－3－羟基－咖啡酸甲酯(3)，咖啡酸(4)，对羟基苯甲酸(5)，原茶酸(6).并对其中3个化合物进行了抗肿瘤活性测定，化合物1、3具有较好的体外抗肿瘤活性，值得进一步深入研究.

［1］国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草:藏药卷［M］.上海:上海科学技术出版社，2002:278－279.

［2］南京中医药大学.中药大辞典［M］.2版.上海:上海科学技术出版社，2006:2687－2688.

［3］中国科学院西北为原生物研究所.藏药志［M］青海:青海人民出版社，1991:183.

［4］刘建英，刘玉梅.青兰属植物的化学成分及药理作用研究进展［J］.食品科学，2012，33(13):314 －319.

［5］高雪.三种菊科植物和一种唇形科植物化学成分及其生物活性研究［D］.兰州:兰州大学，2007.

［6］李云秋，冯育林，杨世林，等.刺山柑化学成分的研究［J］.中草药，2007，38(4):510 －512.

［7］李静，黎莲娘.南丹参化学成分研究［J］.中草药，1994，25(7):347－349.

［8］CHEN Z W，GU WH，WANG W Z.Study on the polyphenolic compounds of Salvia miltiorrhiza［J］.药学学报，1981，9(16):24.