云南肺衣中活性物质提取工艺与抗氧化性能研究

刘满红,刘晓芳,戴建辉,杨华伦,合雪阳

(1.云南民族大学 云南省生物高分子功能材料工程技术研究中心，云南 昆明650500；2.云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南 昆明 650500)

云南肺衣中活性物质提取工艺与抗氧化性能研究

刘满红1,2,刘晓芳1,2,戴建辉1,2,杨华伦1,2,合雪阳1,2

(1.云南民族大学 云南省生物高分子功能材料工程技术研究中心，云南 昆明650500；2.云南民族大学 民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室，云南 昆明 650500)

对云南肺衣活性物质提取工艺与抗氧化活性进行了研究,结果表明，云南肺衣抗氧化活性物质最佳提取工艺为：70%乙醇，料液比为1∶5，温度60 ℃，提取时间3.0 h，提取液对·OH清除率为96.9%，IC50为14.7 mg/mL.

云南肺衣；提取工艺；抗氧化活性；羟自由基

地衣(lichens)是植物界一个特殊类群，是真菌(fungi)和藻类(algae)高度结合的共生复合体，全世界约有地衣植物500余属，26 000 多种.它们分布极为广泛，从南北两极到赤道，从高山到平原，从森林到荒漠均有地衣植物的存在.地衣含有松萝酸、珠光酸、苔色酸等多种独特的次生代谢产物，具有多方面的生物活性[1].近几年的文献报道从地衣植物中分离得到了许多具有活性的新化合物或新天然产物，而国内对地衣化学成分方面的研究已有一些报道[2-3].而我国有丰富的地衣植物资源，尤其是在我国的西南地区，地衣植物在民间可以做药用和食用，其中的云南肺衣(俗名青蛙皮)被大理白族视为纯天然山珍食品.云南肺衣(Lobaria yunnanensis)为肺衣科(Lobariaeeae)肺衣属(Lobaria)地衣植物，常附生于藓及树皮上,在外形上相似于东方肺衣、三苔色肺衣和中华肺衣.

自由基是指能独立存在的含有1个或1个以上的不配对电子的任何原子或原子团,是机体正常代谢的中间产物，在机体内有很强的氧化反应能力且易产生连锁反应，对蛋白质、核酸、脂质等产生伤害作用,从而导致机体的损伤[4].大量的科学实验证实，氧自由基与机体损伤有着非常密切的关系[5]，生物的抗病性、抗逆性及延缓衰老与抗氧化能力密切相关，为当前的研究热点之一.本实验所采用的材料是来自云南大理苍山的云南肺衣，对肺衣的抗氧化活性进行研究，有助于发现具有较好生物活性的天然产物，对地衣植物的分类也有一定的参考价值.

目前国内还未见到用苍山云南肺衣活性物质提取工艺优化及抗氧化研究报道.本文用回流提取法提取植物中活性物质，采用分光光度法，用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+产生的羟自由基，作为评价清除羟基自由基(·OH) 的抗氧化能力，考察了提取时间、提取温度、乙醇溶液浓度、料液比4个单因素的提取液对清除羟自由基的能力，并在单因素实验基础上进行正交实验，以云南肺衣提取物对羟自由基的清除率为评价值，对云南肺衣抗氧化成分的提取工艺进行优化，旨在得到最佳的抗氧化活性物的提取工艺，对开发具有天然抗氧化功能的产品,实现云南肺衣资源的综合利用具有重要的意义.

1 实验部分

1.1 材料与设备

材料：云南肺衣(购于云南大理),将肺衣洗净去除其它附属藻类植物，自然凉干，用粉碎机打碎成肺衣粉，封口袋密封保存.

试剂：邻二氮菲溶液、无水乙醇、氢氧化钠、磷酸氢二钾、硫酸亚铁、pH 7.4磷酸缓冲溶液(PBS)、H2O2溶液；均为分析纯.

仪器：HH-4数显恒温水浴锅(会坛市富华仪器有限公司)，9200型紫外分光光度计(北京瑞利分析仪器公司)，循环水式真空泵(巩义市英峪予华仪器厂)，回流装置，抽滤装置.

1.2 实验方法

1.2.1 提取试剂的确定

以水、石油醚、乙醇、丙酮、乙酸乙酯做溶剂，对云南肺衣抗氧化活性成分的提取进行了初探，其中乙醇提取液效果较好，故选择乙醇作为提取溶剂.

1.2.2 云南肺衣总抗氧化活性物质的提取

准确称取肺衣粉末2.00 g于50 mL具圆底烧瓶中.加入25.00 mL的乙醇，采用回流提取法提取，过滤倒入具塞锥形瓶中，以提取时乙醇浓度为溶剂，定容至50.00 mL作为待测液.

1.2.3 云南肺衣提取物清除羟自由基的抗氧化能力测定

根据文献[6-7]，PBS试液中含40%乙醇，其方法为：量取5.00 mL PBS(50 mmol/L，下同)、2.00 mL蒸馏水和3.00 mL乙醇于试管中，混匀作为空白参比管(A空参)；量取5.00 mL PBS、1.00 mL邻二氮菲(7.50 mmol/L，下同)、1.00 mL FeSO4(7.50 mmol/L，下同)、2.00 mL乙醇和1.00 mL蒸馏水于试管中，混匀作为未损伤管(A未损)；量取5.00 mL PBS、1.00 mL邻二氮菲、1.00 mL FeSO4、2.00 mL乙醇和1.00 mL H2O2(0.1%)于试管中，混匀作为损伤管(A损伤)；量取5.00 mL PBS、1.00 mL样品液、2.00 mL蒸馏水和2.00 mL乙醇于试管中，混匀作为样品参比管(A参比)；量取5.00 mL PBS、1.00 mL邻二氮菲、1.00 mL FeSO4、1.00 mL乙醇、1.00 mL样品液和1.00 mL H2O2于试管中，混匀作为样品管(A样参).将上述试管同时置恒温水浴锅中，37 ℃保温60 min，于536 nm处测吸光度(A)值，每管重复3次，取其平均值，计算对羟自由基清除率：

2 实验结果与讨论

2.1 云南肺衣乙醇提取物清除羟自由基抗氧化活性单因素影响

2.1.1 提取时间对抗氧化活性的影响

以60%乙醇溶液为溶剂，料液比为1∶10，回流温度为60 ℃，改变提取时间，其余按1.2.3节对羟自由基清除率的测定进行，实验结果见图1.由图1可知：·OH清除率随着回流时间的增大而增大，提取时间为3 h达到最大，但提取时间超过3 h后清除率开始减少，提取时间过长，溶液又有一定的温度，可能破坏了肺衣中抗氧化物质，清除率降低，因此提取时间控制在3 h内较为合适.

2.1.2 提取温度对抗氧化活性的影响

提取条件为料液比1∶10，提取时间3 h，改变回流温度，对羟自由基清除率的测定如前，实验结果见图2，由图2可知：清除率随回流温度的增大而增大，提取温度60 ℃为达到最大，但温度超过60 ℃后清除率开始下降，可能是活性物质在高温受损，因此回流温度控制在60 ℃内较为合适.

2.1.3 乙醇体积分数对抗氧化活性的影响

提取条件为料液比1∶10，提取时间3 h，回流温度60℃，改变乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%，对羟自由基清除率的测定如前，实验结果见图3.图3中可看出，清除率随乙醇体积分数的增大而增大，体积分数在60%～70%时增加的比较快，体积分数大于70%后得率开始减小，故选用乙醇体积分数为70%比较适宜.

2.1.4 料液比对抗氧化活性的影响

提取条件:提取时间3 h，回流温度60℃，乙醇浓度为70%，改变料液比，料液比按1∶5、1∶8、1∶10、1∶15分别提取，对羟自由基清除率的测定如前，实验结果见表1，由表1可看出，清除率在开始时随料液比的增大而减小,因此料液比不宜过小，以1∶5比较合适.

2.2 正交实验

基于单因素实验结果，准确称取云南肺衣粉末2.00 g，以不同的提取时间、温度、料液比、乙醇体积分数作为考察的4个因素.各取3个水平，选用L9(34)正交表进行实验[ 8-9 ]，以·OH清除率为指标，研究这几个因素对羟自由基清除率的影响，因素水平和实验结果及极差分析分别见表2、表3.

表1 提取料液比对云南肺衣乙醇提取物抗氧化活性的影响

表2 正交实验因素水平表

表3 L9(34)正交实验结果及极差分析

从极差分析结果可以看出，各因素对羟自由基清除率影响的主次顺序为：D>C>A>B.即乙醇体积分数>料液比>提取时间>提取温度，最佳提取条件为：D3C1A2B2，即乙醇体积分数为70%、料液比为1∶5、提取时间3 h、温度60 ℃.

2.3 精密度的测定

选取正交设计分析的最佳提取工艺条件，重复3次实验，对羟自由基清除率如表4.

表4 羟自由基清除率与分析 %

2.4 质量浓度换算

准确量取6 mL提取液，置于水浴中烘干，准确称量，得出原始提取溶液质量浓度为0.027 mg/mL.

2.5 提取物对羟自由基清除能力

羟基自由基(·OH)是已知的最强的氧化剂，具有极强的反应性.由图4看出，云南肺衣提取物对·OH清除率的上升与质量浓度的增加呈现一定的量效关系，IC50值为14.7 mg/mL.

2.6 提取物抗氧化有效成分的初步鉴定

对肺衣植物提取物进行定性预实验[10]，结果见表5，从表5可初步判断出提取物中的活性成分归属，含有酚类、鞣质、有机酸、多糖等.

表5 云南肺衣提取物抗氧化活性成份的初步鉴定

在定性实验检出的几种成份中，酚类、鞣质具有酚羟基的结构，酚羟基化合物清除自由基的最主要机制是：酚羟基与自由基反应可形成稳定半酮式自由基结构，从而终止自由基链式反应[10-11].有机酸的抗氧化化用近年来受到关注[12-13]，它具有清除自由基、抗氧化等作用，对其它抗氧化剂具有协同增效作用，因此肺衣植物提取物含有的酚类、有机酸等成分构成了其抗氧化作用的物质基础.

3 结语

研究了苍山云南肺衣乙醇提取物的抗氧化能力，在单因素实验基础上进行正交实验，得到提取的最佳工艺条件为：乙醇体积分数为70%、料液比为1∶5、温度60 ℃、提取时间3 h，提取物对羟自由基清除率96.9%，提取物对·OH的IC50为14.7 mg/mL.肺衣中含有酚类、鞣质、多糖、有机酸.

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(责任编辑 庄红林)

Extracting technology and antioxidant activities of bio-active components from Lobaria yunnanensis

LIU Man-hong1,2，LIU Xiao-fang1,2，DAI Jian-hui1,2，YANG Hua-lun1,2,HE Xue-yang1,2

(1．Engineering Research Center of Biopolymer Functional Materials of Yunnan，Yunnan Minzu University，Kunming 650500,China；2．Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education of China,Yunnan Minzu University,Kunming 650031,China)

The extracting technology and antioxidant activities of Lobaria yunnanensis were studied. The results showed that the optimal parameters of the extraction technology were the following: the concentration of ethanol was 70%,the ratio of the extraction sample to the solution was 1∶5,the extraction temperature was 60 ℃,the extraction time was 3 0 h. The extraction under these conditions presented a hydroxyl free radical scavenging ratio of 96.9%. IC50of scavenging ·OH for the extracts of Lobaria yunnanensis was 14.7 mg/mL.

Lobaria yunnanensis; extracting technology; antioxidant activity; hydroxyl free radical

2015-01-09.

国家民委科研资助项目(12YNZ007)；云南民族大学化学与生物技术学院大学生创新性实验项目(2013HXSRT08).

刘满红(1962-)，女，硕士，教授,硕士生导师．主要研究方向:物理化学.

R284

A

1672-8513(2015)02-0140-04