汉族、维吾尔族肾透明细胞癌患者血清差异氨基酸的比较

夏 韩，哈木拉提·吐送，王文光，王玉杰，张立东

（新疆医科大学第一附属医院泌尿中心，乌鲁木齐 830054）

肾癌又称肾细胞癌，其中透明细胞癌约占肾细胞癌的80%左右。肾癌的流行病特征具有显著的地域分布差异，肾肿瘤发病率最高出现在捷克共和国，而在亚洲和非洲以及南美人群中报道的发病率则相对要低［1］，而某些恶性肿瘤（如食管癌）也有较为明显的地域及民族集聚发生的特点。早期肾癌缺乏临床表现，且目前临床缺乏关于肾癌的特异性血清学检验标准，因此寻找肾癌相关肿瘤标记物成为肾癌研究的重要课题及热点［2－3］。肾脏在调节血清氨基酸以及清除血液中含氮物质的过程中起核心作用。而肾小管上皮的主要功能之一就是重吸收原尿中的氨基酸。由于绝大多数肾癌起源于肾小管细胞，而这些肿瘤能改变肾小管重吸收原尿中氨基酸的能力，从而改变血中氨基酸的含量［4］。此外，肿瘤细胞对于氨基酸的需求大于正常细胞，这可能与肿瘤细胞产生能量及增殖方式的改变有关（Warburg效应）［5］。

本实验运用高效液相色谱法对新疆地区主要民族汉族及维吾尔族肾癌患者血清中的17种氨基酸进行测定，同时筛选两族间差异氨基酸，并利用ROC曲线对已测定的汉、维两民族之间有差异的氨基酸进行分析，探讨血清氨基酸的改变对肾癌的诊断价值。

1 材料与方法

1．1 病例选择收集2010年9月至2012年8月新疆医科大学第一附属医院泌尿外科经手术病理诊断确诊为原发性肾透明细胞癌患者96例，其中汉族48例，男34例，女14例；维吾尔族48例，男34例，女14例，肝肾功能正常且排除急性感染、过敏及自身免疫系统疾病，所有肾透明细胞癌均选择Ⅰ期患者，且手术前未行任何治疗。健康对照标本选取年龄、性别、族别相匹配的体检者，肝、肾功能正常且排除急性感染、过敏、自身免疫性疾病，共入组96例体检者：汉族48例，男34例，女14例；维吾尔族48例，男34例，女14例。所有采血均经受检者同意并签署知情同意书。

1．2 样品制备病例组患者入院后行普食，治疗前抽血。两组均抽取清晨空腹静脉血。标本抽取后放入4℃冰箱，1h内处理后放入标本库－80℃冰箱保存。检测时从－80℃ 冰箱内取出样本后使用微量移液器将每份样品取出200μL，加入400μL乙腈萃取，涡旋30s，静置10min，4℃、12 000r／min、离心15min，取上清液至EP管中，40℃氮气吹干，加水200μL复溶后，涡旋30s，使用一次性滤膜过滤后取出10μL按衍生反应要求进行衍生后进样。

1．3 仪器与方法HPLC色谱仪（美国waters e2695HPLC系统配2475荧光检测器及软件工作站），色谱柱（Inertsil C18ODS－SP规格：5μm，4．6×250mm），涡漩搅拌器（IKA MS 3basic）、微量移液器、pH 计（Sartorius，PB－10）、溶剂过滤装置、分析天平（Sartorius，BS110S）、氮吹仪、离心机（Thermo型号：Multifuge X3R）、氮吹仪（HSC－12AHENGAO T﹠D）水浴锅（DK－S22型，上海精宏实验有限公司），Milli－Q（密理博中国有限公司）。乙腈（色谱纯）与甲醇（色谱纯）（Sigma－Aldrich试剂公司提供），17种氨基酸标准品（waters，美国）；AccQ－FlourTM试剂盒（由waters公司提供，包括AQC粉末2A、2B（Reagent Diluent Flammable）和硼酸盐缓冲液各1瓶，临用前取2A粉末加入2B，涡旋并55℃加热溶解后使用。

1．4 数据处理与分析利用HPLC自动进样系统进行血清氨基酸的数据采集，所采用的数据在工作站进行自动积分获得峰面积，根据峰面积计算得出氨基酸浓度。在HPLC衍生中，亮氨酸峰与异亮氨酸峰常常融合，在本文图表中，亮氨酸与异亮氨酸不再分开描述，均表示为亮氨酸＋异亮氨酸。所有数据均采用SPSS 17．0软件进行统计学处理，血浆氨基酸浓度以±s表示，均数的比较采用两独立样本t检验，P值取双侧，以0．05为临界值。

2 结 果

2．1 基本指标将汉族、维吾尔族肾透明细胞癌两组患者的的基本指标作为研究因素。结果表明，汉族与维吾尔族肾透明细胞癌组之间的基本指标比较均无明显统计学差异（P＞0．05，表1）。

表1 两组肾透明细胞癌患者基本指标比较

表1 两组肾透明细胞癌患者基本指标比较

基本指标 汉族肾透明细胞癌组维吾尔族肾透明细胞癌组样本数48 48年龄（岁） 55．46±8．24 52．45±6．74身高（cm） 167．24±8．21 169．25±9．22体重（kg） 68．41±15．2 70．57±13．1体质量指数 24．45±2．42 24．64±2．56

表2 汉族、维吾尔族肾透明细胞癌患者与两族健康人血清氨基酸含量比较

表2 汉族、维吾尔族肾透明细胞癌患者与两族健康人血清氨基酸含量比较

氨基酸 汉族健康组 汉族肾透明细胞癌组 维族健康组 维族肾透明细胞癌组 P1 P2天冬氨酸 0．027 2±0．003 7 0．015 4±0．007 7 0．029 3±0．005 70．024 8±0．018 8 0．019 0．018谷 氨酸 0．044 6±0．011 7 0．060 5±0．030 4 0．048 4±0．014 3 0．092 7±0．053 0 0．053 0．084丝 氨酸 0．275 7±0．016 8 0．115 6±0．047 7 0．217 8±0．056 7 0．133 7±0．045 2 0．003 0．043甘 氨酸 0．518 9±0．029 6 0．195 8±0．079 3 0．524 1±0．172 4 0．251 2±0．137 4 0．001 0．035组 氨酸 0．547 8±0．010 4 0．062 8±0．031 8 0．534 1±0．184 3 0．061 2±0．038 1 0．002 0．007精 氨酸 0．382 2±0．010 2 0．066 9±0．032 8 0．397 7±0．134 1 0．081 6±0．027 4 0．003 0．007苏氨酸 0．183 9±0．016 7 0．130 9±0．058 8 0．199 8±0．045 60．144±0．036 3 0．002 0．048

2．2 汉族、维吾尔族肾透明细胞癌患者与两族健康人血清氨基酸含量的检测结果汉族与维吾尔族肾透明细胞癌患者的血清氨基酸含量分别与两族健康人的血清氨基酸含量进行比较。结果显示，两族肾透明细胞癌患者血清氨基酸含量较之本族健康人血清氨基酸含量整体呈降低趋势。其中除谷氨酸外，其他氨基酸的含量均有统计学差异（P＜0．05，表2）。

续表2 汉族、维吾尔族肾透明细胞癌患者与两族健康人血清氨基酸含量比较

续表2 汉族、维吾尔族肾透明细胞癌患者与两族健康人血清氨基酸含量比较

氨基酸 汉族健康组 汉族肾透明细胞癌组 维族健康组 维族肾透明细胞癌组 P1 P2丙氨酸 0．511 4±0．052 7 0．330 3±0．148 30．588±0．128 5 0．363 3±0．117 4 0．001 0．049脯 氨酸 0．026±0．014 7 0．056 6±0．034 1 0．293 3±0．197 1 0．058±0．040 8 0．004 0．001胱 氨酸 0．176 9±0．005 7 0．041 2±0．021 9 0．193 8±0．065 2 0．048 1±0．021 1 0．000 0．029络 氨酸 0．103 6±0．008 9 0．076 9±0．036 6 0．101 6±0．037 9 0．088 9±0．024 8 0．000 0．048缬 氨酸 0．325 4±0．056 9 0．281 7±0．222 1 0．337 9±0．053 3 0．242 4±0．064 5 0．028 0．034蛋 氨酸 0．116 5±0．003 9 0．026 2±0．011 6 0．117±0．002 9 0．028 6±0．011 2 0．001 0．043异亮氨酸＋亮氨酸0．153 5±0．011 4 0．086±0．035 5 0．155 2±0．014 5 0．100 1±0．027 6 0．000 0．016苯丙氨酸 0．183 6±0．015 8 0．130 3±0．054 1 0．177 7±0．029 2 0．149 9±0．047 1 0．000 0．018赖氨酸 0．150 6±0．009 1 0．075±0．030 4 0．152 4±0．008 7 0．090 3±0．029 4 0．000 0．013 P1：汉族肾透明细胞癌组与汉族健康人比较；P2：维吾尔族肾透明细胞癌组与维吾尔族健康人比较。

2．3 维吾尔族与汉族肾癌患者血清中氨基酸含量比较维吾尔族与汉族肾癌患者血清中氨基酸含量比较，仅3种氨基酸含量有显著性统计学差异（P＜0．05，表3）。

表3 维吾尔族与汉族肾癌患者血清中差异有统计学意义的氨基酸

氨基酸 维族肾透明细胞癌组汉族肾透明细胞癌组 P值天冬氨酸0．024 8±0．018 8 0．015 4±0．007 7 0．028甘氨酸 0．251 2±0．137 4 0．195 8±0．079 3 0．015络氨酸0．088 9±0．024 8 0．076 9±0．036 6 0．041

2．4 天冬氨酸、甘氨酸及络氨酸血清水平对汉族肾透明细胞癌患者诊断价值的ROC曲线评价本研究中，天冬氨酸、甘氨酸及络氨酸对应汉族肾癌患者ROC的曲线下面积（area under curve，AUC%）分别为0．536、0．812及0．814，对应维吾尔族肾癌患者的AUC%分别为0．676、0．804及0．876。其中两民族均以络氨酸的AUCROC最大（图1，表4，表5）。

图1 天冬氨酸、谷氨酸及络氨酸的血清水平对汉族和维吾尔族肾透明细胞癌患者诊断价值的ROC曲线

表4 天冬氨酸、甘氨酸及络氨酸血清水平对汉族肾透明细胞癌患者诊断价值的ROC曲线

表5 天冬氨酸、甘氨酸及络氨酸血清水平对维吾尔族肾透明细胞癌患者诊断价值的ROC曲线

3 讨 论

氨基酸是生命活动中最基本的物质，是生命代谢的物质基础。在肿瘤组织的恶性转化过程中，由于肿瘤细胞动力学的改变，导致机体出现明显的代谢异常，主要表现在肿瘤组织蛋白质的合成增强和氨基酸分解减弱，这可能与肿瘤细胞旺盛生长有关。肿瘤组织为了满足自身的快速生长和细胞的无限制增殖需要从血中摄取某些特定氨基酸，进而引起这些氨基酸在血清中的含量降低［6］。同时肾癌的癌细胞可以侵犯正常肾小管上皮细胞，使肾小管对原尿中的氨基酸重吸收能力降低，从而也可能导致氨基酸在血清中含量的进一步降低。

本研究首先对肾透明细胞癌患者的饮食进行调整，患者入院后尽量行统一普食，以减低氨基酸检测的干扰因素。再利用高效液相色谱法对汉、维两民族中肾癌患者血清和正常健康人血清的17种氨基酸进行定量测定，再分别将两族肾癌患者血清与健康人血清中的17种氨基酸的测定结果进行比较，结果发现，汉、维两族肾癌患者与两族健康人相比血清存在明显的氨基酸代谢异常。两族肾癌患者除谷氨酸外，天冬氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、胱氨酸、络氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸含量呈明显下降趋势，且差异具有统计学意义（P＜0．05）。而汉、维两族肾癌患者之间存在差异的氨基酸为天冬氨酸、甘氨酸及络氨酸。

ROC曲线起初用于雷达信号接受能力的评价，后在上世纪90年代被美国国家临床实验室标准化委员会批准用作实验室试验的临床准确性评价的准则。它将某试验的灵敏度及特异性联系起来，是一种科学的评测方法。通常用AUC来评价ROC曲线，AUC越大，诊断的价值越大，AUC接近0．5时，无诊断意义；AUC＜0．7，表示诊断准确率较低；AUC在0．7～0．9之间，表示诊断准确性中等；AUC＞0．9时，表示诊断有较高的准确性［7］。本研究中，天冬氨酸、甘氨酸及络氨酸对应汉族肾癌患者ROC的AUC%分别为0．536、0．812及0．814，而天冬氨酸、甘氨酸及络氨酸对应维吾尔族肾癌患者的AUC分别为0．676、0．804及0．876。其中两民族均以络氨酸的AUCROC最大，诊断价值最高。

本研究结果表明，研究汉、维两民族之间的差异氨基酸可能为维吾尔族肾癌筛查诊断提供候选生物标志物，初步建立的诊断模型是一种高敏感性、高特异性的筛查诊断方法。在今后的研究中，将扩大样本数，进一步对该模型进行验证，以期待为肾癌的早期诊断提供一条新的方法。

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［6］MAMPASSI DM，YUEQINGG．The applications of amino acids metabolism defection and its drug in tumor therapy［J］．Phar Biotechnol，2012，19（4）：373－376．

［7］赵耐清．临床医学研究设计和数据分析［M］．上海：复旦大学出版社，2005：241－252．