甘草废渣中总黄酮提取工艺研究

刘铭，贾东升，赵江丽，温春秀，崔施展，李荣乔，谢晓亮，*（.河北省农林科学院经济作物研究所，药用植物研究中心，河北石家庄05005；.河北省药品检验研究院，河北石家庄0500）

甘草废渣中总黄酮提取工艺研究

刘铭1，贾东升1，赵江丽2，温春秀1，崔施展1，李荣乔1，谢晓亮1，*
（1.河北省农林科学院经济作物研究所，药用植物研究中心，河北石家庄050051；2.河北省药品检验研究院，河北石家庄050011）

摘要：优化甘草废渣中总黄酮的提取工艺。以甘草苷为对照品，采用比色法测定总黄酮含量，在单因素基础上，采用Box-Benhnken响应面法以总黄酮提取得率（Y，%）为响应值，以乙醇浓度（X1，%），提取时间（X2，min）、液料比（X3，mL/g）及提取次数（X4，次）为自变量，研究各自变量及各自变量间交互作用对总黄酮提取得率的影响，对3批甘草废渣进行验证试验。研究结果表明甘草黄酮最佳提取工艺为：乙醇浓度为70%、提取时间120 min、液料比10∶1（mL/g）、提取次数2次，在优化条件下对3批甘草废渣进行工艺验证，甘草黄酮提取得率为（2.4±0.34）%（n=3），与预测理论值2.39%接近。利用Box-Behnken响应面法优化得到的甘草废渣总黄酮提取工艺参数可靠，方法简便，预测性良好。

关键词：甘草废渣；响应面；总黄酮

甘草为豆科植物甘草、胀果甘草或光果甘草的干燥根和根茎，甘草主要成分为甘草酸、甘草次酸等三萜皂苷类化合物和查尔酮、二氢黄酮等黄酮类化合物，具有补脾益气，清热解毒，调和诸药等功效[1-3]。新疆是我国最大的甘草产地和甘草初加工基地，新疆甘草品质优良，其供应量约占全国甘草用量的50%。在甘草的利用过程中，甘草多用水提取，制备甘草酸、甘草次酸，提取完成后产生大量药材废渣，多数生产企业将其作为废弃物直接丢弃，不仅造成了浪费资源还污染环境，简单的水提无法使药材中的黄酮类化合物充分转移，甘草残渣中仍存在大量黄酮类物质。研究表明甘草黄酮具有抑菌、抗炎、抗氧化、抗溃疡、抗抑郁、抗肿瘤、抗HIV等活性，广泛应用于药品、食品、化妆品等多个领域[4-6]，具有广泛的使用前景和较高的经济价值。本课题组研究了甘草废渣总黄酮的提取工艺，为甘草废渣的再次利用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

甘草废渣（水提取后的药渣干燥品）：新疆；甘草苷对照品（含量≥98%）：中国药品生物制品检定所；氢氧化钾（20140715，分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；甲醇（20140721，分析纯）：天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇（20140102，分析纯）：天津市光复科技发展有限公司；水为高纯水；数控超声提取机：济宁天华超声电子仪器有限公司；电子天平（十万分之一）：梅特勒托利多；752PC型紫外光可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1对照品溶液的制备

取甘草苷对照品5 mg，精密称定，甲醇定容至10 mL，配得0.5 mg/mL对照品母液。

1.2.2标准曲线

取对照品溶液0.6、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mL甲醇定容至10 mL，即得系列对照品溶液。取系列对照品溶液1 mL，加入10%KOH溶液1 mL，静置5 min，甲醇定容至10 mL，即得，在334 nm处测定吸光度，10%KOH溶液1 mL甲醇定容至10 mL作为对照[7]。吸光度A对溶液浓度C回归得：Y=0.056X+0.022，r=0.999，甘草苷浓度在3 μg/mL～12 μg/mL范围内线性关系良好。

1.2.3响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选取60%、70%、80%乙醇溶液作为提取溶剂，提取时间90、120、150 min，液料比8∶1、10∶1、12∶1（mL/g）及提取次数1、2、3次为自变量，甘草总黄酮提取得率为响应值，采用Box-Benhnken响应面法对甘草总黄酮的提取工艺进行优化，并且按最优提取条件进行验证试验。因素水平见表1。

表1Box-Benhnken响应面分析试验因素与水平Table 1　Factors and levels in the Box-Benhnken experimental design

2　结果与分析

2.1响应面优化试验结果

在单因素试验基础上，以甘草黄酮提取得率（Y，%）为因变量，选取乙醇浓度（X1，%）、提取时间（X2，min）、液料比（X3，mL/g）及提取次数（X4，次）为自变量，采用四因素三水平的Box-Benhnken响应面法进一步优化甘草黄酮提取得率（Y，%），试验设计及响应值结果见表2。

表2　Box-Behnken响应面分析方案及试验结果Table 2　Experimental design and corresponding results for response surface analysis

采用“Design expert 7.0”试验设计软件，对表2试验数据进行处理，以因变量分别对各自变量拟合回归方程及进行方差分析，结果见表3。

对表3中试验数据进行回归拟合，得到甘草黄酮提取得率对所选4个因素的二次多项回归方程为：

表3　回归方程中系数的显著性及方差分析Table 3　Significance test of coefficient and analysis of variance for regression equation

对数据进行处理结果表明，方程的模型显著（P< 0.01），说明模型有意义；失拟差不显著（P>0.05），说明模型与试验值的差异较小，该模型拟合程度良好，可以用回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析和预测。表3中一次项X1和X4水平均显著（P<0.05）；交互项X1X2和X1X4水平显著（P<0.05）；二次项X12、X22、X32、X42水平均极显著（P<0.01）。

2.2响应面分析图

考察所拟合的响应曲面的形状，分析乙醇浓度、提取时间、液料比及提取次数对甘草黄酮提取得率的影响，各因素之间的交互作用对甘草黄酮提取得率影响见图1。

4个因素水平选值合理，回归模型存在最大值，最佳落点在试验考察的区域内。由该模型预测得到的最佳提取工艺为：乙醇浓度为70.5%、提取时间为118 min、液料比为9.8∶1（mL/g）、提取次数为2次。

2.3验证试验

为了验证模型的可靠性，采用修正后的提取条件：乙醇浓度为70%、提取时间为120 min、液料比为10∶1（mL/g）、提取次数为2次，平行试验3次。3次验证试验，甘草黄酮提取得率为（2.4±0.34）%，与理论预2.39%测值非常接近，证明该回归模型可靠，可用于代替试验真实点对试验结果进行分析和预测。

图1　各因素交互作用对甘草总黄酮得率影响的响应面图Fig.1　Response surface plots showing the interaction effects of four reaction conditions on the yield of total fiavonoids

3　结论与讨论

本研究采用Box-Benhnken响应面法优化甘草废渣中总黄酮提取工艺，通过单因素及响应面法筛选出了较适提取工艺，乙醇浓度为70%、提取时间为120min、液料比为10∶1（mL/g）、提取次数为2次，甘草黄酮提取得率为2.4%。

甘草废渣为甘草提取甘草酸后工业废渣，其中含有大量黄酮类成分，主要为查耳酮及二氢黄酮，具有较强的抗氧化、消炎抑菌等药理活性，被广泛应用于食品及化妆品领域[8]。我国甘草资源丰富，但由于过度的开采，造成甘草资源急剧减少，同时也造成生态环境的恶化，因此针对甘草废渣的再利用的研究显得尤为重要，甘草废渣的再利用不仅缓解了甘草资源匮乏的局面，减少了甘草废渣对环境的污染，同时利用甘草废渣为原料制备甘草黄酮具有较大的经济及社会价值。

参考文献：

[1]罗祖良,李倩,覃洁萍,等.光果甘草的研究进展[J].中草药,2011, 42(10):2154-2158

[2]赵虹,蒋江涛,郑秋生.甘草查耳酮A药理作用研究进展[J].中国中药杂志,2013,22(38):3814-3818

[3]李艳宾,张琴,陶呈宇,等.微生物发酵提高甘草渣中黄酮类物质提取率的研究[J].食品研究与开发,2010,31(9):156-159

[4]黄东,卜凯,阳毅,等.甘草黄酮对运动大鼠体内糖及脂肪组织RBP4 mRNA表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(2): 124-128

[5]樊紫周,赵伟鸿,果嘉,等.甘草黄酮的抗抑郁作用及对海马脑区神经再生的保护作用[J].药学学报,2012,47(12):1612-1617

[6]崔誉蓉,陈朋,刘军花,等.4种甘草黄酮类化合物抗氧化构效关系研究[J].时珍国医国药,2010,21(12):3041-3043

[7] 冯薇,王文全,赵平然.甘草总黄酮含量测定方法研究[J].时珍国医国药,2007,18(11):2608-2610

[8]杨琳,车庆明,毕诚,等.甘草废渣中黄酮成分的研究[J].中草药, 2007,38(5):671-673

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.019

收稿日期：2015-10-22

基金项目：河北省农林科学院青年基金项目（A2015050101）；河北太行山区特色功能保健食品的开发研究（11231005D）；河北省中药材产业体系项目（11232025D）

作者简介：刘铭（1976—），男（汉），副研究员，本科，主要从事中药种植加工研究。

*通信作者：谢晓亮（1962—），男，研究员，博士，主要从事中药资源、中药加工研究。

Optimization of Extraction Parameters of Total Flavonoids from Licorice Residue

LIU Ming1，JIA Dong-sheng1，ZHAO Jiang-li2，WEN Chun-xiu1，CUI Shi-zhan1，LI Rong-qiao1，XIE Xiao-liang1，*
（1.Institute of Cash Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Centre of Medicinal Plant Research，Shijiazhuang 050051，Hebei，China；2.Hebei Institute for Drug Control，Shijiazhuang 050011，Hebei，China）

Abstract：Extraction parameters of total flavonoids from licorice residue was optimized by response surface method.The total flavonoids content was determined by colorimetric method.The effect ofethanol concentration，extraction time，the ratio of material to liquid ratio and extraction times was studied.The effect of each factor and interaction on the extraction rate of total flavonoids was studied.3 batches of licorice residue were used for validation test under the optimized conditions.Research results showed that thebest extraction parameters was：ethanol concentration 70%，extracting time 120 min，ratio of 10∶1（mL/g），extracting times of 2，the extraction rate of flavonoids was（2.4±0.34）%（n=3），the difference was little between 2.39%predictions.The extraction parameters of total flavonoids from licorice residue obtained by Box-Behnken response surface method were reliable，simple and convenient.

Key words：licorice residue；response surface；total flavonoids