桔梗乙醇提取物的抑菌活性研究

周兰华，张海悦（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012）

桔梗乙醇提取物的抑菌活性研究

周兰华，张海悦*
（长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春130012）

摘要：对桔梗95%乙醇提取物做体外抑菌试验，测试该提取物对受试菌的最低抑菌浓度，考察温度、pH、紫外照射时间对抑菌活性的影响，运用系统预试验分析醇提物的化学成分。在7种受试菌中，桔梗醇提物对变形杆菌的抑制作用最强，大肠杆菌次之，两者的最低抑菌浓度均为125 mg/mL。桔梗乙醇提取物对细菌的抑菌作用要强于真菌，而对革兰氏阴性菌的抑菌效果强于革兰氏阳性菌。醇提物对温度和紫外光具有良好的稳定性，pH在4～6时，有良好的抑菌作用。预试验表明桔梗醇提物的活性成分可能有皂苷、三萜类、多酚、黄酮等。

关键词：桔梗；乙醇提取物；抑菌活性

桔梗Platycodon grandiflorus（Jacq.）A.DC.为桔梗科（Campanuaceae）桔梗属（Platycodon）植物，广泛生长于中国、朝鲜半岛、日本和西伯利亚东部，是我国药食同源的植物之一。桔梗性平味苦、辛，归肺经，具有化痰止咳、宣畅肺气、祛痰排脓之功效，可用于治疗外感咳嗽、咽喉肿痛、肺痈吐痰等症[1]。大量研究表明，桔梗富含皂苷、多糖、黄酮、多酚、甾体、萜类等成分，并含有十多种氨基酸及镁、铁、锌等多种微量元素[2]。现代药理研究显示，桔梗具有保肝、抗炎、抗肿瘤、抗氧化、降血脂、降血糖、调节免疫等功效[3]。

近年来，国内外学者对桔梗化学成分、药理作用等方面做了大量的研究，尤其在对桔梗皂苷和桔梗多糖方面的研究[4-7]，取得了很大成就。但是对桔梗提取物抑菌活性方面的研究却鲜有报道。李娜证明了桔梗多糖抑制真菌的能力强于抑制细菌的能力[8]。

目前，使用于食品工业中的防腐剂大多数是化学防腐剂，其安全性、稳定性备受消费者质疑，因此开发安全、高效的植物天然防腐剂是食品防腐研究的热点。本研究用桔梗95%乙醇提取物对食品中常见腐败菌的抑菌活性进行探讨，研究了提取物抑菌活性的稳定性，旨在为新型天然防腐剂的开发以及桔梗植物资源的综合利用提供理论参考。

1　材料与仪器

1.1材料

1.1.1原料

桔梗：吉林长春。由东北师范大学生命科学学院鉴定为桔梗（Platycodon grandiflorus）的干燥根茎。

1.1.2供试菌种

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、变形杆菌（Proteusbacillus vulgaris）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、青霉（Penicillium）、黑曲霉菌（Aspergillus niger）：由长春工业大学化学与生命科学学院微生物实验室保存。

1.2仪器

DZKW-S-8电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器厂；RE52-98旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；AL204电子天平：梅特勒-托利仪器（上海）有限公司；pHS-3C型实验室pH计：上海伟业仪器厂；BCN-1360型生物洁净工作台：北京东联哈尔仪器制造有限公司；SANYO MLS-3750型高压灭菌锅：SANYO Electric Co.，Ltd.；HPX-9082数显电热培养箱：上海博讯实业有限公司。

1.3试剂

乙醇、氯化钠、琼脂、葡萄糖均为分析纯；牛肉膏、蛋白胨均为生物试剂：购自于北京奥博星生物技术有限公司。

2　方法

2.1培养基[9]

2.1.1牛肉膏蛋白胨培养基的制备

牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15 g～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121℃高压灭菌30 min。

2.1.2马铃薯葡萄糖培养基的制备

马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15 g～20 g，蒸馏水1 000mL，自然pH，121℃高压灭菌30 min。

在配制液体培养基时，采用以上培养基配方，不加琼脂即可。

2.2菌悬液的制备

将供试菌经斜面活化后，用接种环挑取1环～3环于灭菌后装有25 mL液体培养基的三角瓶里，置生化培养箱里，细菌37℃培养18 h～24 h，真菌28℃培养48 h～72 h后，制成含菌数约108cfu/mL菌悬液。

2.3桔梗乙醇提取物的制备

称取20 g桔梗粉末，加入500 mL乙醇（95%），在60℃恒温水浴锅中回流提取3 h，过滤，旋转蒸发浓缩至无醇味后，加入蒸馏水定容至20 mL，则桔梗醇提物浓度为1.0 g/mL，即每毫升提取物中含有原料桔梗1.0 g。本文中涉及的桔梗醇提物浓度均按此定义。

2.4抑菌试验——滤纸片法

取固体培养基25 mL加入到灭过菌的培养基内，待固体培养基凝固之后加入1.0 mL供试菌液均匀涂布。将桔梗醇提物溶液用0.22 μm微孔滤膜过滤，把灭菌后的滤纸片（直径为9 mm）放在其中浸泡30 min，取出滤纸片在无菌条件下自然风干，取经上述处理的滤纸片贴于培养皿表面，每个培养皿放4片滤纸。其中，3张为浸过提取液的滤纸，其余一张滤纸为浸过无菌蒸馏水的空白对照。细菌于37℃培养24 h、真菌于28℃培养48 h后，观察并测定抑菌圈直径大小，做3次平行试验，结果取平均值。

2.5最低抑菌浓度（MIC）——试管稀释法

用无菌蒸馏水按两倍稀释法配制500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63 mg/mL 6个不同浓度提取液系列。将配制好的液体培养基按每试管4.0 mL分装，121℃湿热灭菌30 min，待冷却后，准确吸取1.0 mL上述6个系列试液，加入到液体培养基试管中，即得到6个不同浓度的提取液系列培养基。每一系列培养基接种一种菌，菌液体积为1.0 mL，每个浓度做3次平行实验，另取一列以1.0 mL无菌蒸馏水代替菌液做空白对照，置于37℃下恒温培养，每隔两小时观察生长情况。将提取液的接种系列和不接种任何试验菌的空白系列相对照，两者透明度相同的最低浓度即为提取液的最低抑菌浓度（MIC）[10]。

2.6醇提物抑菌活性的稳定性试验

2.6.1温度对桔梗醇提物抑菌活性的影响

将直径为9 mm的滤纸片放在小三角瓶中经121℃30 min湿热灭菌，分别移取10 mL醇提物于6个上述处理过的小三角瓶中，在20、40、60、80、100、121℃条件下各处理30 min。以变形杆菌和大肠杆菌为指示菌，用滤纸片法测定各组抑菌圈的直径，结果取平均值，重复该操作1次。

2.6.2pH对桔梗醇提物抑菌活性的影响

分别移取10 mL醇提物于6个灭菌后的小三角瓶中，用1.0 mol/L的HCl和NaOH配制成pH为4、5、6、7、8、9的系列溶液，放入直径为9 mm经121℃30 min湿热灭菌后的滤纸片，浸泡30 min。以变形杆菌和大肠杆菌为指示菌，用滤纸片法测定各组抑菌圈的直径，结果取平均值，重复该操作1次。

2.6.3紫外照射时间对桔梗醇提物抑菌活性的影响

分别移取10 mL醇提物于5个含有滤纸片并灭菌后的小三角瓶中，放置在无菌超净台中，紫外灯分别照射15、30、45、60 min，以不经紫外照射（即照射时间为0 min）为对照组。以变形杆菌和大肠杆菌为指示菌，用滤纸片法测定各组抑菌圈的直径，结果取平均值，重复该操作1次。

2.7桔梗乙醇提取物抑菌活性成分的初步分析

通过对醇提物进行化学成分系统预试验，对具有抑菌效果的桔梗醇提物中可能含有的有效成分进行测定。

3　结果

3.1抑菌试验结果

抑菌试验结果见表1。

表1 桔梗醇提物的抑菌活性Table 1　The antibacterial activity of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

通过比较抑菌圈直径的大小可以看出，当桔梗醇提物的浓度为1.0 g/mL时，桔梗醇提物对青霉和黑曲霉无明显抑菌作用，而对其余5种受试细菌表现出良好的抑菌作用，尤其是对变形杆菌的抑菌作用最强，大肠杆菌次之。此外，醇提物对革兰氏阴性菌的抑菌效果要强于其对革兰氏阳性菌的抑菌效果。

3.2最低抑菌浓度（MIC）

试管稀释法测定桔梗醇提物最低抑菌浓度的结果如表2所示。

表2　桔梗乙醇提取物的最低抑菌浓度Table 2　The minimum inhibitory concentration of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

将各样品试管与对照试管相比较，以试管内液体培养基的浑浊度一致来判定是否长菌。表2结果表明：随着桔梗醇提物浓度的增加，对细菌的抑菌能力增加。桔梗醇提物对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、嗜热链球菌的最低抑菌浓度均为250 mg/mL；对变形杆菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度均为125 mg/mL。

3.3温度对桔梗醇提物抑菌活性的影响

温度对桔梗醇提物抑菌活性的影响如图1所示。

图1　温度对桔梗醇提物抑菌活性的影响Fig.1　The effect of temperature on antibacterial activity of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

从图1可以看出，在121℃范围内，温度对桔梗醇提物抑菌效果无影响，桔梗醇提物经不同温度处理后仍然能保持原有的抑菌活性。说明该抑菌物质的结构未遭到破坏，即该抑菌物质对温度的抵抗性较高，具有很好的热稳定性。

3.4pH对桔梗醇提物抑菌活性的影响

pH对桔梗醇提物抑菌活性的影响如图2所示。

图2　pH对桔梗醇提物抑菌活性的影响Fig.2　The effect of pH on antibacterial activity of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

由图2可知，pH对桔梗醇提物的抑菌能力影响很大。在pH为4～6之间时，酸碱度对抑菌活性的影响不大，但当pH偏中性或碱性时，抑菌效果显著下降甚至没有效果。原因可能是醇提物经NaOH溶液处理之后，其中的抑菌成分被破坏而失去抑菌活性。

3.5紫外照射时间对桔梗醇提物抑菌活性的影响

紫外照射时间对桔梗醇提物抑菌活性的影响如图3所示。

图3　紫外照射时间对桔梗醇提物抑菌活性的影响Fig.3　The effect of UV irradiation time on antibacterial activity of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

从图3可知，紫外照射一个小时之内，照射时间对醇提物的抑菌活性无明显影响，说明该抑菌物质对紫外光具有很好的稳定性。

3.6桔梗乙醇提取物抑菌活性成分的初步分析

桔梗醇提物抑菌活性成分的初步分析结果见表3。

表3　桔梗乙醇提取物系统预实验结果Table 3　The results of pre-experiments of ethanol extract from Platycodon grandiflorum

根据系统预试验的结果可知，醇提物中可能含有皂苷、三萜类、多酚、甾体、黄酮、油脂以及有机酸。

4　结论

本试验证明了桔梗95%乙醇提取物具有较好的抑菌作用，且对细菌的抑菌能力要强于真菌，抑菌活性的稳定性良好，具备开发成天然防腐剂的优势。预试验的结果可以指导桔梗化学成分的深入分析，然而，对桔梗醇提物抑菌活性成分的分离、结构鉴定、抑菌活性的机理等更多相关的内容还需要进一步研究。

参考文献：

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[8]李娜.桔梗多糖的分离纯化及生物活性研究[D].齐齐哈尔:齐齐哈尔大学,2012:44-50

[9]周德庆.微生物学实验手册[M].上海:上海科学技术出版社,1986: 250-260

[10]耿晓玲,张白曦,徐丽丽,等.杨梅果实提取物抑菌特性的研究[J].食品科技,2007,32(3):120-125

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.23.009

收稿日期：2014-03-15

作者简介：周兰华（1990—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：天然产物提取。

*通信作者：张海悦（1967—），女（汉），教授，博士，研究方向：食品及农副产品深加工。

Antibacterial Activity of Ethanol Extract from Platycodon grandiflorum

ZHOU Lan-hua，ZHANG Hai-yue*
（School of Chemistry and Life Science，Changchun University of Technology，Changchun 130012，Jilin，China）

Abstract：It was studied on the in vitro antibacterial activity of 95%ethanol extract from Platycodon grandiflorum，and determined the minimum inhibitory concentration against the bacteria tested.At the same time，the effect of temperature，pH，UV irradiation time on antibacterial activity were tested，the chemical composition of alcohol extract was analyzed by pre-experiments as well.Among the seven bacteria tested，Bacillus proteus was the most inhibitive one，then Escherichia coli.The minimum inhibitory concentrations of both were 125 mg/mL.Platycodon grandiflorum ethanol extract had better antibacterial activity on bacteria than on fungus，and the antimicrobial effect on Gram negative bacteria was better than on Gram positive bacteria.The ethanol extract had good stability to temperature and ultraviolet light.When pH was between 4 and 6，the antimicrobial effect showed good.Pre-experiments showed that the active component of Platycodon grandiflorum might be triterpenoid，polyphenols，flavonoids.

Key words：Platycodon grandiflorus；ethanol extract；antibacterial activity