快速液相色谱法测定龟苓膏中绿原酸和芦丁

李晓晶，于鸿，谢进（广州市疾病预防控制中心，广东广州510440）

快速液相色谱法测定龟苓膏中绿原酸和芦丁

李晓晶，于鸿，谢进
（广州市疾病预防控制中心，广东广州510440）

摘要：建立高分离度快速液相色谱RRLC法同时测定龟苓膏中绿原酸、芦丁的方法。采用采用ZORBAXSB-C18柱（150mm×4.6mm，1.8μm），乙腈-0.4%磷酸水溶液为流动相的梯度洗脱模式分离各测定组分，采用可变波长的方式测定相应组分的峰面积并计算样品含量。绿原酸和芦丁分别在0.009 42μg～0.471μg（r=0.999 9）和0.000 85μg～0.044 25μg（r=0.999 8）范围内具有良好的线性关系；且平均加样回收率分别为101.77%（RSD=1.2%，n=6）和99.84% （RSD=1.4%，n=6）；重复性试验，2个成分含量的RSD均小于2.0%（n=6）。

关键词：龟苓膏；绿原酸；芦丁；高分离度快速液相色谱

龟苓膏是龟板、金银花、槐花、地黄、土茯苓、茵陈、火麻仁、甘草等药味组成，临床用于虚火烦躁，口舌生疮，津亏便秘，热淋白浊，赤白带下，皮肤瘙痒，疖肿疮疡等[1]。绿原酸和芦丁作为龟苓膏中主要药材金银花和槐花的特征有效成分，具有广泛的抗菌消炎、利胆、止血及增高白血球数量的作用[2]。目前针对芦丁和绿原酸的测定国家已出台了相应标准（GB/T22250-2008《保健食品中绿原酸的测定》），其中芦丁的测定方法为紫外分光光度法、绿原酸的含量为高效液相色谱法[3-5]。为有效控制龟苓膏的质量，笔者通过相应的方法学考察建立了以高分离度快速液相色谱RRLC法同时测定龟苓膏中绿原酸和芦丁2个指标成分含量的方法。结果表明，所建立方法简便、快速、准确，可用于龟苓膏的质量控制。

1　仪器与试药

1.1仪器

安捷伦1200型高分离度快速效液相色谱仪（RRLC），包括G1314-SL型二级管阵列检测器（安捷伦科技有限公司，美国）；METTLER TOLEDO AG245型电子分析天平、METTLER TOLEDO XP26型电子分析天平（梅特勒-托利多国际股份有限公司，德国）；BRANSONB5510E-MT型超声仪（必能信超声有限公司，美国）。

1.2试药

龟苓膏6个批次，生产厂家及自编号分别为：东莞市正膏坊龟苓膏有限公司，自编号1201、1202；广西梧州双钱实业有限公司，自编号1203、1204；广州潘高寿天然保健品有限公司，自编号1205、1206。绿原酸对照品（批号110753-200413）和芦丁对照品（批号11080-200707，含量90.5%）均购自中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯；水为超纯水；甲醇和磷酸为分析纯。

2　方法与结果

2.1色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（150 mm×4.6 mm，1.8μm）；流动相：乙腈（A）-0.4%磷酸水溶液（B），梯度洗脱条件见表1；检测波长，采用可变波长分别测定绿原酸327 nm，芦丁257 nm，见表1；流速1mL/min，柱温：35℃；进样体积：各2μL。

表1　梯度洗脱条件及相应的检测波长

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品贮备液

取经五氧化二磷减压干燥12 h以上的绿原酸和芦丁各2mg，精密称定，置10mL棕色量瓶中，加流动相制成绿原酸浓度为235.5μg/mL和芦丁浓度为221.25μg/mL的混合对照品贮备液。

2.2.2混合对照品溶液

精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品贮备液1mL，置5mL棕色量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得。

2.2.3供试品溶液

取本品，研细，取约15 g，精密称定，置50mL棕色量瓶中，加流动相40mL，超声处理30min，放冷，加流动相稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4阴性对照溶液

分别取按处方工艺制备的不含金银花、槐花的阴性样品，按“2.2.3”项下方法制得阴性对照溶液。

2.3方法学考察和样品测定

2.3.1系统适用性及专属性考察

分别吸取上述混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各10μL，按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录色谱图。结果，供试品样品中绿原酸、和芦丁均与杂质峰完全分离，绿原酸和芦丁的理论板数均不低于3 000，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

图1　龟苓膏中绿原酸和芦丁的色谱图Fig.1　The chrom atogram of chlorogenic acid and rutin in Guiling Paste

2.3.2线性关系考察

精密吸取“2.2.1”项下的混合对照品贮备液6份各1.00mL，分别置50、25、10、5、2、1mL棕色量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件测定，记录色谱峰峰面积。以进样量（X，ng）为横坐标，以峰面积（Y）为纵坐标，得绿原酸和芦丁的回归方程分别为Y=20.380 6X-15.019 3（r=0.999 9）和Y=13.523 7X+ 2.780 8（r=0.999 8）。结果表明绿原酸在0.009 42μg～0.471μg和芦丁在0.000 85μg～0.044 25μg范围内均呈良好的线性关系。

2.3.3精密度试验

精密吸取混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果，绿原酸和芦丁的RSD%分别为1.26%及1.06%。表明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性试验

取同一份供试品溶液，分别于0、2、5、10、15、24 h进样2μL，记录峰面积。结果绿原酸和芦丁的RSD%分别为1.48%及0.83%。表明供试品溶液在24h内稳定。

2.3.5重复性试验

取供试品（自编号：1201）适量，匀浆，按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，分别进样测定。结果，绿原酸和芦丁的平均含量分别为14.732mg/kg和5.262 g/kg，RSD分别为1.83%和0.98%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.3.6加样回收率试验

取同一批样品（自编号：1201）6份，每份约7.5 g，置50 mL棕色量瓶中，分别精密加入含绿原酸0.115 67mg/mL和芦丁0.040 32mg/mL的混合溶液各1.00m L，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果，绿原酸平均回收率为101.77%，RSD为1.2%；芦丁的平均回收率为99.84%，RSD为1.4%。表明该方法回收率良好。结果见表2。

表2　绿原酸和芦丁加样回收试验结果（n=6）Tab le2　The recoveriesof chlorogenic acid and rutin

2.3.7样品测定

取本品，研细，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，用标准曲线法以峰面积计算样品中各测定成分的含量，结果见表3。

表3　样品含量测定结果（n=6）Table 3　The content resultsofsamples

3　结论与讨论

3.1检测波长的选择

经DAD扫描（波长200 nm～400 nm），确定绿原酸和芦丁各自的检测波长分别为327 nm及257 nm。结果，在相应的测定波长条件下，2种成分均具有理想的响应值，且重复性良好。

3.2流动相的选择

因待测定组分绿原酸呈显弱酸性，所以选择有机相-酸水溶液做流动相，当选择甲醇（A）-醋酸水溶液（B）作流动相时，由于甲醇的黏度较大，在改变洗脱梯度时，整个系统的压力会明显升高，且基线波动较大；而选择乙腈（A）-醋酸水溶液（B）作流动相时，基线波动较大；最后，选择乙腈（A）-磷酸水溶液（B）作流动相时，得到了较满意的色谱图，经过比较，发现采用乙腈（A）-0.4%的磷酸溶液（B）作流动相，并按本文的梯度比例洗脱时，色谱图的分离效果理想，保留时间适宜。

3.3小结

本方法对3个厂家6批龟苓膏中绿原酸和芦丁2种成分进行了含量测定，结果表明本方法能够在同一色谱条件下测定龟苓膏中主要成分的含量，有利于控制产品的质量。

参考文献：

[1]陈润阶,冯亦,黎天德.黑色天然食品龟苓膏的营养保健作用[J].中国食品卫生杂志,1994(S1):51-52

[2]杜延兵,裘爱泳.绿原酸生物活性,资源及其提取纯化[J].现代食品科技,2006,22(2):250-252

[3]中华人民共和国卫生部.GB/T22250-2008保健食品中绿原酸的测定[S].北京:中国标准出版社,2008:1-3

[4]吴婕.高效液相色谱法测定龟苓膏中的绿原酸[J].光谱实验室, 2010,27(1):254-256

[5]时维静,李立顺,陆凤琪,等.可见及紫外分光光度法测定中药复方总黄酮的比较[J].中国卫生检验杂志,2008,18(6):1071-1073

DO I：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.19.041

收稿日期：2015-03-23

作者简介：李晓晶（1982—），女（汉），主管技师，硕士，主要从事食品卫生检验工作。

RRLC Simultaneous Determ ination of Ch lorogenic Acid and Rutin in Guiling Paste

LIXiao-jing，YUHong，XIE Jin
（Guangzhou Centers for DiseaseControland Prevention，Guangzhou 510440，Guangdong，China）

Abstract：To establish a RRLCmethod ofsimultaneously determining the contentof chlorogenic acid and rutin in Guiling Paste.Sampleswere separated by ZORBAX SB-C18column（150mm×4.6mm，1.8μm）.Acetonitrile -0.4%phosphoric acid wasmobile phasewith both a gradientelutionmode and a variable detectingwavelength in order to determine the concentration of the respective components simultaneously.Chlorogenic Acid and Rutin all had good linearity in the rangesof0.009 42μg-0.471μg（r=0.999 9）and 0.000 85μg-0.044 25μg（r=0.999 8），correspondingly.The average recoverieswere 101.77%（RSD=1.2%，n=6）；and 99.84%（RSD=1.4%，n=6），respectively.Repeatability experiments presented that RSD valuesof their contentswere less than 2.0%.

Keywords：Guiling Paste；chlorogenic acid；rutin；RRLC