乳与乳制品中三聚氰胺快速检测方法

王玉英，柴艳兵，张耀广，赵媛媛，张玉娟，闫立红（石家庄君乐宝乳业有限公司质量管理中心，河北石家庄050021）

乳与乳制品中三聚氰胺快速检测方法

王玉英，柴艳兵，张耀广，赵媛媛，张玉娟，闫立红
（石家庄君乐宝乳业有限公司质量管理中心，河北石家庄050021）

摘要：研究了高效液相色谱法检测乳与乳制品中三聚氰胺的检测方法。采用三氯乙酸和乙腈提取后，用高效液相色谱测定。该方法的检出限为0.5mg/kg，相对标准偏差为1.09%～1.99%，回收率在95.15%～99.12%之间。与GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》第一法高效液相色谱法（HPLC法）相比，处理时间缩短了约3 h。关键词：高效液相色谱；三聚氰胺；乳；乳制品

三聚氰胺（英文：Melamine）（化学式：C3H6N6），俗称密胺、蛋白精，IUPAC命名为“1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺”，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，被用作化工原料。三聚氰胺含氮量很高（66%），加之生产工艺简单、成本很低，在采用凯氏定氮法测定粗蛋白时，可提高表观粗蛋白含量；不法生厂商为了降低生产成本，提高经济效益，在奶粉中加入三聚氰胺；一次大量摄入或长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，形成膀胱、肾部结石，并可进一步诱发膀胱癌。

自2008年以来，报道的三聚氰胺的检测方法主要有高效液相色谱法[1-14]、液相色谱-质谱/质谱法[15-18]气相-质谱法[19-21]、液相-质谱法[22]、液相色谱-电喷雾串联质谱法[23-25]、离子交换色谱-紫外检测法[26]、酶联免疫吸附分析法（ELISA）[27]等。在这些方法中，高效液相色谱法的样品处理方法通常要过固相萃取小柱，气相-质谱、液相-质谱、液相色谱-电喷雾串联质谱方法中样品必须衍生化，其前处理方法时间长，且检测费用较高。ELISA方法检测费用较高。本试验建立了HPLC的快速、灵敏、准确的检测方法，检测费用低，样品处理时间短，仅需20min。本方法可完全满足乳与乳制品安全检测的需要。

1　材料与方法

1.1试剂

方法中所用试剂，除另有规定外，均为分析纯试剂，水为超纯水。

试剂：乙腈（色谱纯）、氨水（含量为25%～35%）、甲醇（色谱纯）、柠檬酸、辛烷磺酸钠（色谱纯）。

1%三氯乙酸：称取1 g三氯乙酸用水定容到100mL。

离子对试剂缓冲液：准确称取2.10 g柠檬酸和2.16 g辛烷磺酸钠加入约980mL水溶解，调节pH至3.0后，用超纯水定容至1 000m L。

甲醇水溶液（50%）：准确量取50mL甲醇和50mL水，混匀后备用。

氨化甲醇溶液（5%）：准确量取5mL氨水和95mL甲醇，混匀后备用。

三聚氰胺标准储备液：精密称取三聚氰胺0.0250g，用50%甲醇溶解并定容至25mL的容量瓶中，混匀，即得1 000μg/mL三聚氰胺标准储备液。

三聚氰胺标准工作液：准确移取5.00m L三聚氰胺标准储备液于50mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，混匀即得100μg/mL三聚氰胺标准工作液。

1.2设备

高效液相色谱仪Agilent1260（配有DAD或VWD）；离心机；超声波清洗器；分析天平：感量为0.01mg；电子天平；一次性过滤器；针头过滤器（有机系0.45μm）；涡旋混合器。

1.3方法

1.3.1检测原理

试样中三聚氰胺经三氯乙酸和乙腈提取后，用高效液相色谱测定，外标法定量。

1.3.2标准工作曲线

分别吸取三聚氰胺标准工作液0.0、0.25、0.5、1.0、2.0、2.5mL，置于25mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，得到三聚氰胺质量浓度分别为0、1、2、5、8μg/mL 和10μg/mL标准系列液，分别进行HPLC分析。

1.3.3样品处理

原料乳、灭菌乳及乳粉：准确称取2.5 g（精确至0.01 g）试样于25mL容量瓶中，加入10mL1%三氯乙酸溶液，加入5m L乙腈，振荡混匀，用三氯乙酸定容至25m L。混匀超声提取10min～20min。3 500 r/min～4 000 r/min以上离心10min，经0.45μm滤膜过滤，HPLC分析。

酸奶及蛋白饮料：准确称取2 g（精确至0.01 g）试样于25mL容量瓶中，加5mL乙腈溶解，用超纯水定容至25mL，振荡混匀超声提取10min～20min后离心，3 500 r/min～4 000 r/min以上离心10min，经0.45μm滤膜过滤，HPLC分析。

1.3.4仪器条件

色谱柱：C18（4.6mm×250mm，5.0μm）。

流动相：离子对试剂缓冲液-乙腈（80+20，体积比）混匀，过滤备用。

流速：1mL/min；进样量：20μL；柱温：40℃；波长：240 nm。

1.3.5上机测试

将三聚氰胺标准系列液依次注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积。

将制备好的试样溶液注入高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积。用保留时间定性，外标峰面积法定量。

2　结果与分析

2.1三聚氰胺标准工作曲线

三聚氰胺质量浓度在0.5mg/L～8mg/L范围内，标准工作曲线呈线性关系，曲线的回归方程为：y= 36.280 69x，相关系数R=0.999 98。三聚氰胺标准工作曲线如图1所示。

图1　三聚氰胺标准工作曲线Fig.1　The standard working curve ofmelam ine

2.2最低检测限

取空白样品测定3次，由仪器测得基线噪音（6*SD）平均值。

根据GB/T 5009.1-2003《食品卫生检验方法理化部分总则》中A2.1色谱法的检出限计算公式为：

式中：b为标准曲线回归方程中的斜率，响应值/ μg或响应值/ng；S为仪器噪音的3倍，即仪器能辨认的最小的物质信号。

经计算得到的该方法的检出限为：0.5mg/kg。2.3准确度

根据方法的检出限，分别对2.0、2.5、4.0mg/kg 3个点进行了加标回收率试验，结果见表1。

表1　液态奶中三聚氰胺加标回收率Table 1　Liquidm ilkmelam ine recoveries

续表1　液态奶中三聚氰胺加标回收率Contiune table 1　Liquid m ilkmelam ine recoveries

由表1可以看出3个梯度的加标回收率结果在95.15%～99.12%。

2.4精密度

精密度结果见表2。

表2　精密度试验（n=3×6）Table2　Precision test（n=3×6）

通过对两个未知浓度的样品分别重复测定6次，得到的相对标准偏差在1.09%～1.99%之间。

2.5稳定性

稳定性检测结果见表3。

表3　稳定性试验Table3　Breakdown test

通过对未知浓度的样品在常温（15℃～25℃）下，分别在放置2、5、10 d后进行检测，得到的相对标准偏差为1.55%。

3　结论

采用三氯乙酸和乙腈提取后，用高效液相色谱测定，外标法定量。该方法的检出限为0.5mg/kg，相对标准偏差为1.09%～1.99%，回收率在95.15%～99.12%之间。与GB/T 22388-2008《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》第一法HPLC相比，处理时间缩短了约3 h。该方法检测乳与乳制品中三聚氰胺，简便易行，准确性和精密度高，适用于乳与乳制品中三聚氰胺的检测。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.22.038

收稿日期：2014-03-21

作者简介：王玉英（1982—），女（汉），工程师，硕士研究生，主要从事食品检测方法研究。

Determ ination of Melam ine in M ilk and Dairy Products

WANGYu-ying，CHAIYan-bing，ZHANGYao-guang，ZHAOYuan-yuan，ZHANGYu-juan，YANLi-hong
（Shijiazhuang Junlebao dairy co.ltd，Quality ManagementCenter，Shijiazhuang 050021，Hebei，China）

Abstract：In this paper，HPLC was used to detect themelamine in raw milk and dairy products.In HPLC method，melamine was extracted by trichloroacetic acid and acetonitrile.The detection limit of thismethod is 0.5mg/kg，the relative standard deviation was1.09%-1.99%and the recoveriesbetween 95.15%-99.12%. Compared with the firstmethod in GB/T 22388-2008，thismethod processing time is reduced byabout3 h.

Key words：HPLC；melamine；milk；dairy products