HPLC法测定宁夏红葱中槲皮素与山奈酚的含量

刘慧燕，方海田，张光弟，史　娟，张永健（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

HPLC法测定宁夏红葱中槲皮素与山奈酚的含量

刘慧燕，方海田*，张光弟，史娟，张永健
（宁夏大学农学院，宁夏银川750021）

摘要：以宁夏同心红葱、盐池红葱以及市售白葱为材料，采用甲醇+超声波提取法对样品中的槲皮素与山奈酚进行了提取，并根据正交试验设计确定最佳提取条件。用高效液相色谱法，以保留时间定性、外标法定量，研究葱样中槲皮素和山奈酚的含量，对色谱条件进行优化，并比较分析了两个地区红葱与市售白葱中的槲皮素和山奈酚含量差异。结果表明，方差分析可知槲皮素与山奈酚的最佳提取条件为：超声温度为60℃、时间为50 min、甲醇浓度为75%；最佳色谱条件为：色谱柱XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱温为30℃，流动相为甲醇0.5%冰醋酸（30∶70），流速1.0 mL/min，检测波长为290 nm。通过比较分析可知，红葱中槲皮素与山奈酚含量均明显高于市售白葱，而盐池红葱中槲皮素与山奈酚含量也均明显高于同心红葱。

关键词：宁夏红葱；槲皮素；山奈酚；提取；测定

红葱（学名：Allium cepa var.proliferum）是百合科（Liliaceae）葱属（Allium）洋葱的变种。在我国，红葱种植范围很广，主要分布于东北、华北、西北及西南地区，在陕西、河北、甘肃、宁夏、河南、福建、广东等地均有种植[1]。在宁夏红葱种植主要分布在同心和盐池地区，其中宁夏同心地区种植红葱近万亩，盐池也有上千亩的种植，为当地带来了显著的经济效益。

对葱属植物的研究始于上世纪，国内外学者对其化学成分及药理作用已进行了大量研究，分离出多种类型化合物[2]。李光富等[3]分析了葱内生真菌是否具有与其宿主（葱）相同或相似生理活性成分，为葱内生真菌抗菌活性开发应用做了一些研究。徐金钟等[4]对红葱中的抗稻瘟霉活性成分进行了研究。潘俊等人[5]研究了红葱中抑制植物病原菌活性的成分。迄今为止，只从该属植物中分离出十几个化合物[6]，这些化合物有萘酚类、萘酮类、蒽醌类和葡萄糖苷类[7]，它们为红葱属植物的主要活性成分。其中，山奈酚（Kaempferol）与槲皮素（Quercetin）都属于黄酮类物质，可作为药品，具有较好的祛痰、止咳作用，并有一定的平喘作用[5-8]。此外还有降低血压、增强毛细血管抵抗力、减少毛细血管脆性、降血脂、扩张冠状动脉，增加冠脉血流量等作用[9]，其含量检测分析多采用高效液相色谱法[10-12]。槲皮素与山奈酚的化学结构式如图1、图2所示。

图1　槲皮素的化学结构式Fig.1　Chemical structure of quercetin

图2　山奈酚的化学结构式Fig.2　Chemical structure of kaempferol

本研究主要以宁夏同心和盐池红葱为原料，通过超声波+甲醇提取法提取红葱中的黄酮类物质槲皮素与山奈酚，采用高效液相色谱法对红葱中的槲皮素和山奈酚进行了定性定量分析，并与银川市售白葱进行了对比分析，为充分挖掘红葱在保健食品和药品开发研究方面的潜力，提升宁夏红葱的深加工和综合利用水平、促进农民增收和脱贫致富提供技术支撑和思路。2.5 mg/mL槲皮素溶液，分别取0.4、0.5、1.0 mL，定容于10 mL容量瓶，分别得0.1、0.125、0.25 mg/mL槲皮素标准液。称取山奈酚标准品3.8mg，溶于10 mL容量瓶，取2.5 mL，定容于10 mL容量瓶，分别得到0.38 mg/mL 和0.095 mg/mL浓度标准液。

1.2.2提取方法

本试验采用超声波+溶剂萃取法提取葱样品中的有效成分。其提取流程如下：

葱样品→切段、冻干粉碎→超声波辅助提取→甲醇净提→旋转蒸干→石油醚脱色→回收溶剂（旋转蒸干）→粗提物→真空冷冻干燥→粗提物

在溶剂萃取中，影响得率的主要因素有超声温度、超声时间和甲醇浓度等，本研究的工艺条件范围是：温度45℃～75℃，时间为30 min～70 min，甲醇的浓度50%～95%。采用三因素三水平正交试验方法进行设计，最后根据冻干后的提取物和冻干葱样的质量计算得率。

1.2.3色谱条件的选择

利用 easysep1010型高效液相色谱仪，Agilent XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，分别采用3种流动相甲醇-0.5%冰醋酸溶液、甲醇-0.2%磷酸、甲醇-0.4%磷酸水溶液；流速为1.0 mL/min，检测波长290 nm，柱温30℃。比较谱图分离情况来确定最佳流动相，在最佳流动相的基础上调整流动相配比，选出有机相和水相的最佳配比，最后确定最佳色谱条件。

1.2.4红葱与白葱中槲皮素和山奈酚含量的测定

进样量20 μL，根据2.2.3的最佳色谱条件，对不同浓度标准品的峰面积和浓度做工作曲线得出回归方程，对样品进行同样操作计算出样品的色谱峰面积，根据回归曲线计算出样品中槲皮素与山奈酚的浓度，从而得到红葱与白葱中槲皮素与山奈酚的含量。

1　材料与方法

1.1材料

红葱样品分别取自同心、盐池二地；白葱为银川市售；槲皮素、山奈酚均为分析纯：购自sigma公司；甲醇、冰醋酸、石油醚、磷酸均为色谱纯：购自天津市大茂化学试剂厂。

1.2方法

1.2.1标准品溶液的制备

称取槲皮素25 mg，定容于10 mL容量瓶中，得到

2　结果分析

2.1正交试验结果

采用三因素三水平正交试验方法进行设计，根据冻干后的提取物和冻干葱样的质量计算得率。结果如表1。

表1　正交试验表及结果Table 1　Orthogonal test and results

图3　不同流动相时的槲皮素与山奈酚色谱图Fig.3　Chromatogram of quercetin and kaempferol in different mobile phase by HPLC

续表1　正交试验表及结果Continue table 1　Orthogonal test and results

由表1数据分析可知，因素主次顺序为A＞C＞B，优化水平为A2B3C2，即超声温度（A）为60℃、超声时间（B）50 min、甲醇浓度（C）75%。在正交试验中超声波+甲醇提取最佳条件为超声温度为60℃、时间为50 min、甲醇浓度为75%。

2.2HPLC测定条件的确定

2.2.1流动相成分的确定

当选择流动相为：甲醇-0.2%磷酸，流速：1.0mL/min，其中甲醇为0.8 mL/min，0.2%磷酸为0.2mL/min，检测波长290 nm，柱温30℃时，色谱分离效果如图3（a）所示。当流动相为：甲醇-0.4%磷酸，流速：1.0 mL/min，其中甲醇为0.8 mL/min，0.4%磷酸为0.2 mL/min，检测波长290 nm，柱温30℃时，其色谱分离效果如图3（b）所示。当流动相为：甲醇-0.5%冰醋酸，流速：1.0 mL/min，其中甲醇为0.8 mL/min，0.5%冰醋酸为0.2mL/min，检测波长290 nm，柱温30℃时，其色谱分离效果如图3 （c）所示。

比较分析可知，采用流动相为甲醇-0.5%冰醋酸，流速：1.0 mL/min，其中甲醇为0.8 mL/min，0.5%冰醋酸为0.2 mL/min，检测波长290 nm，柱温30℃时，槲皮素与山奈酚的分离效果最好，所以选择该流动相为最终测定时所用的流动相。

2.2.2流动相比例的确定

选择采用甲醇-0.5%冰醋酸作为流动相，对流动相中有机相与水相的最佳配比进行研究，结果如图4 中a、b、c、d分别所示。

当有机相与水相的比例为50∶50时，如图4（a）中所示。当有机相与水相的比例为60∶40时，如图4（b）中所示。当有机相与水相的比例为10∶90时，如图4 （c）中所示。当有机相与水相的比例为30∶70时，如图4（d）中所示。对各图谱比较分析，可以看出，在以甲醇-0.5%冰醋酸为流动相时，当有机相与水相比例为30∶70时，槲皮素与山奈酚的分离效果最好，故选择该30∶70为流动相的有机相与水相的最佳配比。结果表明，测定红葱中槲皮素与山奈酚含量时采用的色谱条件为：以甲醇-0.5%冰醋酸（30∶70）为流动相，流速：1.0 mL/min，检测波长290 nm，柱温30℃。

2.3不同地区红葱中槲皮素含量的测定结果

分别取同心、盐池红葱样品液20 μL，采用以上色谱条件进行测定。色谱分离测定结果表明，样品中槲皮素与山奈酚色谱分离效果良好，由所得峰面积计算得出同心红葱中槲皮素的含量为0.969 3 mg/mL，盐池红葱中槲皮素的含量为1.283 1 mg/mL。

2.4不同地区红葱中山奈酚含量的测定结果

分别取同心、盐池红葱样品液20 μL，采用以上色谱条件进行测定。色谱分离测定结果表明，样品中槲皮素与山奈酚色谱分离效果良好，由所得峰面积计算得出同心红葱中山奈酚的含量为1.833 2 mg/mL，盐池红葱中山奈酚的含量为2.251 9 mg/mL。

2.5不同地区红葱及白葱中槲皮素、山奈酚含量的比较分析

按照上述测定方法对银川市售白葱中的槲皮素与山奈酚含量分贝进行了测定，结果得出，槲皮素的含量为0.623 1 mg/mL，山奈酚的含量为1.074 4 mg/mL，如表2中所示。

图4　不同比例甲醇-0.5%冰醋酸时的槲皮素与山奈酚色谱图Fig.4　Chromatogram of quercetin and kaempferol in different ratio of methanol-0.5%acetic acid by HPLC

表2　红葱中槲皮素和山奈酚含量测定结果Table 2　The contents of quercetin and kaempferol in red onions

通过对比分析可以看出，2个地区红葱中槲皮素与山奈酚的含量远远高于白葱；同时，盐池红葱中的槲皮素和山奈酚含量又明显高于同心红葱，如图5所示。

图5　不同产地葱中槲皮素和山奈酚含量比较Fig.5　Comparison the contents of quercetin and kaempferol of onions in different area

3　结论

1）本试验采用超声波+甲醇提取法对红葱中的槲皮素与山奈酚进行提取，最佳提取条件为超声温度为60℃、超声时间为50 min、甲醇浓度为75%。对得到的供试品溶液利用高效液相色谱法进行了测定，确定最佳色谱条件为：色谱柱XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇：0.5%冰醋酸=30∶70，流速为1.0 mL/min，检测波长290 nm，柱温30℃。

2）对两个不同地区的红葱中槲皮素和山奈酚含量的进行测定分析，并与市售白葱中的含量进行了对比。结果表明，同心红葱中槲皮素与山奈酚含量分别为（0.969 3±0.03）mg/mL和（1.833 2±0.08）mg/mL；盐池红葱中槲皮素与山奈酚含量分别为（1.2831±0.04）mg/mL和（2.2519±0.06）mg/mL；市售白葱中槲皮素与山奈酚含量分别为（0.6231±0.01）mg/mL和（1.074 4±0.03）mg/mL。通过比较分析，红葱中槲皮素与山奈酚含量均明显高于市售白葱，而盐池红葱中槲皮素与山奈酚含量也均明显高于同心红葱，这可能与当地的环境、气候、种植方法有关，有待进一步研究。

参考文献：

[1]邹忠梅,于德泉,丛浦珠.葱属植物化学及药理研究进展[J].药学学报,1999,34(5):395-400

[2] 刘西京,阎玺庆,王乃利.红葱化学成分研究[J].中草药,2012,43 (2):223-225

[3] 李光富,汪正威,李雪玲.葱内生真菌抑菌活性初探[J].楚雄师范学院学报,2008,23(9):75-80

[4]徐金钟,邱峰,曲戈霞,等.红葱抗稻瘟霉活性成分研究[J].中国药物化学杂志,2005,15(3):157-161

[5]潘俊,张焱珍,李晚谊,等.红葱抑制植物病原菌活性成分研究[J].西南农业学报,2011,24(6):2246-2248

[6]J Bystrická,J Musilová,A Vollmannová,et al.Bioactive components of onion(Allium cepa L.)-a Review[J].Acta Alimentaria,2013, 42(1):11-22

[7]Eun-Ju Yanga,Sang-In Kimb,Sang-Yun Park,et al.Fermentation enhances the in vitro antioxidative effect of onion(Allium cepa)via an increase in quercetin content[J].Food and Chemical Toxicology, 2012,50(6):2042-2048

[8]党军,张兴旺,陶燕铎,等.高效液相色谱法测定野葱中黄酮类化合物[J].化学研究与应用,2012,24(2):282-286

[9]刘建涛,王杉,张维民,等.葱属植物生物活性物质的研究进展[J].食品科学,2007,28(4):348-350

[10]浦锦宝,梁卫青,郑军献,等.HPLC法测定三叶青中槲皮素、山奈酚的含量[J].中国中医药科技,2011,18(2):134-135

[11]典灵辉,吴铁,吕应年.HPLC法测定黄芪中槲皮素和山奈酚的含量[J].现代医药卫生,2007,23(17):2550-2551

[12]Jun WATANABE,Jun TAKEBAYASHI,Yuko Takano-ISHIKAWA, et al.Evaluation of a method to quantify quercetin aglycone in onion (Allium cepa)by single-and multi-laboratory validation studies[J]. Analytical Sciences,2012,28(12):1179-1182

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.036

收稿日期：2014-05-22

基金项目：宁夏回族自治区科技支撑计划--育种专项课题（2014）；宁夏科技扶贫致富指导员项目（nxkjt201406）

作者简介：刘慧燕（1977—），女（汉），讲师，硕士，研究方向：农产加工及贮藏工程。

*通信作者：方海田（1978—），男（汉），讲师，博士，研究方向：食品生物技术。

HPLC Determination of Quercetin and Kaempferol in Allium cepa var.Proliferum from Ningxia

LIU Hui-yan，FANG Hai-tian*，ZHANG Guang-di，SHI Juan，ZHANG Yong-jian
（College of Agriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China）

Abstract：The determination method and extracting conditions of flavonoids in two types of red onions from Ningxia were mainly investigated，and compared with those of Chinese onions in our study.Taking Tongxin red onions，Yanchi red onions and Chinese onions as the research objects，extract of quercetin and kaempferol were extracted with methanol+ultrasonic extraction methods from three different samples，and the extraction conditions was optimized by the orthogonal experimental design methods.Then the contents of quercetin and kaempferol in three different samples were determined by high-pressure liquid chromatography（HPLC），and the determination conditions were optimized.The results showed that the optimum extraction conditions were：ultrasonic temperature 60℃，ultrasonic time 50 min，methanol concentration 75%.The optimal determination conditions were Agilent XDB-C18column（250 mm×4.6 mm，5 μm），the column temperature was 30℃，mobile phase was methanol：0.5%acetic acid=30∶70，the flow rate was 1.0 mL/min，the detection wavelength was 290 nm.As the comparative analysis，the contents of quercetin and kaempferol in two red onions were significantly higher than those of Chinese onions，and the contents of quercetin and kaempferol in Yanchi red onions were obviously higher than those of Tongxin red onions.

Key words：Allium cepa var.proliferum；quercetin；kaempferol；extraction；determination