猪骨汤中的游离氨基酸及其呈味特征分析

赵　静，丁　奇，孙　颖，陈怡颖，张玉玉，孙宝国，陈海涛（北京工商大学食品营养与人类健康北京高精尖创新中心，食品质量与安全北京实验室，北京市食品风味化学重点实验室，北京100048）

基础研究

猪骨汤中的游离氨基酸及其呈味特征分析

赵静，丁奇，孙颖，陈怡颖，张玉玉*，孙宝国，陈海涛
（北京工商大学食品营养与人类健康北京高精尖创新中心，食品质量与安全北京实验室，北京市食品风味化学重点实验室，北京100048）

摘要：为了研究猪骨汤中的游离氨基酸及其呈味贡献，采用氨基酸分析仪对肋排汤、棒骨汤、脊骨汤、扇骨汤4种猪骨汤的游离氨基酸进行测定，并用电子舌分析其滋味轮廓，进行对比分析。结果表明：4种猪骨汤中均分离出17种游离氨基酸，其中有7种必需氨基酸。棒骨汤中总游离氨基酸的含量最高（24.65 mg/g），肋排汤中最低（12.61 mg/g）。4种猪骨汤中鲜味氨基酸种类最少（2种），但其中谷氨酸的相对质量分数均为16.69%～19.96%，TAV值为6.84～16.02，远高于其他游离氨基酸，对猪骨汤滋味贡献程度最大。电子舌检测分析得出，棒骨汤滋味轮廓和其他3种有差异，而其他3种差异不明显。

关键词：猪骨汤；游离氨基酸；味道强度值；电子舌；主成分分析

猪骨是猪肉产业的主要副产物，资源丰富[1]。猪骨汤凭借其鲜味均衡，厚味突出，香味悠长的特点深受国人喜爱。在烹制过程中，猪骨中的脂肪、氨基酸、蛋白质等营养成分在浓度差及温度的作用下逐渐释放出来，形成营养丰富、味道鲜美、极易吸收的浓厚汤汁[2]。其中，游离氨基酸是猪骨汤中重要的呈味物质[3-6]，其种类及含量会直接影响汤的鲜美程度。游离氨基酸还可以作为前体物质与还原糖发生美拉德反应，生成肉类的独特风味。

国内外对猪骨的研究主要集中在骨蛋白的提取、软骨素的提取、骨多肽的制备、骨明胶的制备、骨泥的再生产工艺以及对其营养成分的研究[7]。晋佳路等[8]研究了猪骨肽中氨基酸质量的分析，发现猪骨肽中含有丰富的多种天然氨基酸，其中谷氨酸、甘氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、精氨酸、赖氨酸、亮氨酸等8种氨基酸是猪骨肽中存在的主要氨基酸；王全利等[2]分析了排骨汤加工过程中游离氨基酸的变化，发现在烹饪中猪肉汤中总游离氨基酸和必需游离氨基酸的都呈现上升趋势；杨铭铎等[9]还研究了提取方法对猪骨汤中营养成分的影响，发现相对于微波法及传统蒸煮法，酶解法明显提高了猪骨水解液中游离氨基酸的含量和质量。但对于猪骨汤中，游离氨基酸对滋味贡献的分析研究较少。

为了进一步确定猪骨汤中游离氨基酸的呈味特性，本文通过加热炖煮得到4种不同部位猪骨汤，采用氨基酸分析仪对猪骨汤中氨基酸种类及含量进行测定，计算其游离氨基酸味道强度值（taste activity value，TAV），并用电子舌对其滋味轮廓进行对比验证，以期为猪骨汤调味基料的研究和制备提供一定的理论依据。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1材料

市售肋排、棒骨、扇骨、脊骨，糖、黑胡椒、料酒、醋、葱、姜、复合香辛料，购于北京永辉超市。

复合香辛料：八角∶桂皮∶肉蔻∶陈皮∶花椒∶香叶∶小茴香=6∶6∶8∶7∶5∶6∶9。

1.1.2试剂

18种混合氨基酸标准溶液：百灵威科技有限公司；氨基酸分析仪Loading Buffer（色谱纯）：大昌华嘉商业（中国）有限公司；0.01 mol/L的HCl、NaCl、MSG溶液：法国Alpha MOS公司。

1.2仪器与设备

30+氨基酸自动分析仪：英国Biochrom公司；TGL16M台式高速冷冻离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；Eppendorf AG移液枪：德国Eppendorf公司；ALPHA 2-4 LSC冷冻干燥机：德国Marin Christ公司；AstreeⅡ电子舌系统：法国Alpha MOS公司；DGD40-40 DWG微电脑隔水电炖锅：广东天际电器有限公司。

1.3方法

1.3.1标准曲线的绘制及定量方法

混合标准氨基酸溶液中有天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸，每个浓度都是0.25 μmol/mL。将标准溶液与Loading Buffer按体积比1∶2、3∶8、1∶4、1∶8 和1∶32分别配制成共5个浓度的溶液。将5个不同浓度梯度氨基酸标准溶液在同样的条件下进样，在将得到每种氨基酸的峰面积对浓度作图绘制17种氨基酸标准曲线，采用的是峰面积外标法进行定量。

1.3.2样品前处理

1.3.2.1猪骨汤的制备

称取相同质量（100 g）不同部位的去肉猪骨，切成边长约5 cm的小块，用沸水焯后加入2.5倍水、0.1%的蔗糖、0.1%的黑胡椒、0.3%的醋、1%的料酒、0.025%复合香辛料、0.7%葱和姜，放入隔水炖锅中，在营养汤模式下加热3 h。

1.3.2.2样品前处理

取4种猪骨汤分别进行离心，离心的条件：9 600 r/min，10 min，4℃。离心结束后分别取4种猪骨汤上清液，一部分直接用于电子舌分析，另一部分于小烧杯中进行冷冻干燥，取适量冻干粉加入一定量的Loading Buffer，0.45 μm亲水滤膜过滤，进行氨基酸分析。

1.3.3检测条件

氨基酸分析仪参数设置：BiochromNa型阳离子交换树脂，4.6μm×200mm；测定波长在570nm和440nm；缓冲液流速25 mL/h，31.2 mL/h；柱温31℃～76℃；茚三酮溶液流速20 mL/h；进样量20 μL。每个样品重复进样3次。

电子舌参数设置：采用交叉型传感器，在室温下测量，每个样品重复7次，数据采集时间为180 s，以水为清洗溶液清洗20 s[10]。测量前对电子舌进行自检、活化、校准和诊断等步骤，以确保采集所得数据的可靠性和稳定性。

1.3.4分析方法

1.3.4.1游离氨基酸组成及含量分析

根据标准曲线计算4种猪骨汤中各游离氨基酸、必需氨基酸（essential amino acids，EAA）、非必需氨基酸（nonessential amino acids，NEAA）和呈味氨基酸（delicious amino acids，DAA）的含量及氨基酸总量（total amino acids，TAA）。

1.3.4.2猪骨汤滋味的分析

参照文献[11]，计算猪骨汤中各种游离氨基酸的味道强度值（TAV），找出有显著贡献的氨基酸。当TAV值大于1时，认为该物质对呈味有贡献，而TAV值小于1时，认为该物质对呈味没有贡献[12]，由此可以确定主要呈味的氨基酸。

1.3.4.34种猪骨汤整体滋味的对比评定。

利用电子舌对4种猪骨汤的滋味轮廓进行区分辨别，从整体上对猪骨汤进行对比分析，用电子舌自带的软件进行主成分分析（principal component analysis，PCA），主成分分析是在力求数据信息丢失最少的原则下，对高维的变量空间降维，即研究指标体系的少数几个线性组合，并且这几个线性组合所构成的综合指标将尽可能多地保留原来指标变异方面的信息[13]。

2　结果与分析

2.1标准氨基酸的图谱及回归方程的建立

游离氨基酸的标准曲线是以峰面积为横坐标，以氨基酸的浓度（μmol/mL）为纵坐标。图1是17种氨基酸标准品的色谱图。表1是17种氨基酸回归曲线和相关系数。脯氨酸在440 nm出峰，其它16种氨基酸在570 nm出峰。

图1　17种氨基酸标准品的色谱图Fig.1　17 kinds of amino acids standard Chromatograms

表1　17种氨基酸回归曲线和相关系数Table 1　17 kinds of amino acid regression curve and correlation coefficient

2.24种猪骨汤中游离氨基酸种类及质量分析

图2分别是肋排汤、棒骨汤、脊骨汤、扇骨汤的氨基酸分离图谱。

图2　4种猪骨汤的氨基酸分离图谱Fig.2　The amino acid separation diagram in four kinds of pig bone soup

由图2可以看出，17种氨基酸的分离效果较好，检测出的17种游离氨基酸与晋佳路等[8]的研究成果一致，其中必需氨基酸种类均是7种。

表2是4种不同猪骨汤中游离氨基酸的种类及含量。

从表2中可以看出，4种猪骨汤游离氨基酸的种类均相同，但含量不同。肋排汤和脊骨汤中含量最高的为丙氨酸，其次为谷氨酸；棒骨汤和扇骨汤中含量最高的是谷氨酸，其次为丙氨酸。

4种猪骨汤中氨基酸总量最高的为棒骨汤（24.65 mg/g），其次为扇骨汤（22.70 mg/g）、脊骨汤（14.63 mg/g），最低的为肋排汤（12.61 mg/g）。棒骨汤中的呈味氨基酸含量也最高，为23.88 mg/g，占其氨基酸总量的96.90%。

从必需氨基酸总量（EAA）分析比较，4种猪骨汤中均具有苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸7种必需氨基酸。必需氨基酸总量最高的是棒骨汤（8.15 mg/g），其次为扇骨汤和脊骨汤，分别为6.97 mg/g、2.87 mg/g，最少的是肋排汤为2.79 mg/g。根据必需氨基酸占氨基酸总量比值（EAA/ TAA）比较可得出，棒骨汤比值最高（33.07%），其次依次是扇骨汤（30.71%）、肋排汤（22.15%）、脊骨汤（19.62%）。根据必需氨基酸与非必需氨基酸比值（EAA/NEAA）比较得出的结果为，棒骨汤的比值最高（49.42%），脊骨汤最少（24.41%）。

表2　4种不同猪骨汤中游离氨基酸的种类及含量（n=3）Table 2　The type and concentration of free amino acid in four kinds of pig bone soup（n=3）

2.34种猪骨汤呈味特性及TAV分析

滋味有酸、甜、苦、咸和鲜5种感受，呈味氨基酸的含量对猪骨汤的口感起着至关重要的作用。根据参考文献[14-16]，游离氨基酸分成鲜、甜和苦3类，苦味氨基酸的种类为9种，鲜味氨基酸为2种，甜味氨基酸为5种。游离氨基酸是肉类重要的滋味呈味和香味前体物质，如苏氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、赖氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸等具有甜味[17]；天冬氨酸、谷氨酸产生酸味；精氨酸、组氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸等产生苦味[18]。

表3为4种不同部位猪骨汤游离氨基酸的味道强度值。

表3　4种不同部位猪骨汤游离氨基酸的味道强度值Table 3　Taste intensity value of free amino acid in four kinds of pig bone soup

由表3可以看出，4种猪骨汤滋味有贡献的氨基酸种类排序结果为：棒骨汤（11种）＞扇骨汤（9种）＞脊骨汤（6种）＞肋排汤（5种）。其中呈鲜味的氨基酸种类最少，但在4种猪骨汤中谷氨酸TAV值都最高，对滋味的贡献度最大，谷氨酸鲜味很强，对汤风味具有重要贡献[19]，具有形成肉鲜味和缓冲咸与酸等味道的特殊功效[20]。4种骨汤的苏氨酸、脯氨酸、异亮氨酸、亮氨酸TVA值均小于1，对汤滋味贡献程度不大。甜味也是猪骨汤的一个主要特征味道，甘氨酸和丙氨酸等呈味氨基酸具有舒适的甜味，4种猪骨汤中的甘氨酸、丙氨酸TVA＞1，对滋味贡献很大。4种猪骨汤中苦味氨基酸种类最多，但是猪骨汤中鲜有苦味感，因苦味氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸，当其含量低于呈味阈值时，可增强其它呈味氨基酸的鲜味和甜味[21]，如苦味氨基酸精氨酸，有增加呈味复杂性和提高鲜度的作用[22]。

表4为4种猪骨汤中味觉氨基酸的相对质量分数。

从表4可以看出，肋排汤和脊骨汤鲜味氨基酸的相对质量分数相差不大，棒骨汤和扇骨汤鲜味氨基酸质量分数差异不大。在4种猪骨汤中，丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸等甜味氨基酸所占的比例较高，赋予了猪骨汤甘甜爽口的特性，还能减少苦味，缓解食物中不快口味[23]。其中脊骨汤中的甜味氨基酸的相对质量分数最高（60.13%），滋味比其他3种更甘甜；棒骨汤中的甜味氨基酸相对质量分数最少（46.52%）。棒骨汤中苦味氨基酸质量分数最高（33.39%），脊骨汤中最低（22.18%）。

2.44种猪骨汤电子舌对比分析

图3为4种猪骨汤电子舌检测的PCA分析图及判别指数。

表4　4种猪骨汤中味觉氨基酸的相对质量分数Table 4　The relative mass fraction of taste amino acid in 4 kinds of pig bone soup

图3　4种猪骨汤电子舌检测的PCA分析图及判别指数Fig.3　PCA analysis diagram and discrimination index detected by electronic tongue in four pig bone soup

电子舌检测得到的结果是由7个传感器检测样品的酸、甜、苦、咸、鲜口感的综合结果组成，电子舌在检测的过程中，样品需要至少重复5次，因为电子舌的第一次检测结果一般与后来的检测结果相差比较大，为了得到比较真实的数据，尽量将实验的重复次数维持在6次～7次左右[25]。主成分分析中方差贡献率最大的视为第1主成分，贡献率次之的为第2主成分，以此类推。第1、第2主成分方差贡献率之和主要反映了样本整体差异性信息在主成分平面上的完整程度[26]，当方差贡献率累积达到85%以上时就认为所选的几个主成分能够反映原来指标的信息[27]。图3显示了电子舌检测和区分不同部位猪骨汤的PCA分析图及判别指数（discrimination index，DI），7个传感器主成分1 （principal component value 1，PCV1） 和主成分 2 （principal component value 2，PCV2）的累积方差贡献率为97.68%大于85%，这说明主成分1和2包含样品大量信息，可以反映4种样品的整体信息。经PCA分析后得到的区别指数是判断电子舌是否能区分样品的重要指标，一般当DI值＞80时，认为对样品具有良好的区分度[27]。棒骨汤与其他3种猪骨汤的DI分别为88.75%、88.17%、88.88%，均大于80%，说明棒骨汤可以跟其他3种的滋味分开，但肋排汤、脊骨汤、扇骨汤却不能很好地分开，其判别指数都小于80%，其中差异最大的是棒骨汤和扇骨汤，差异最小的是肋排汤和扇骨汤。

3　结论

1）棒骨汤中游离氨基酸总量最高（24.65 mg/g），肋排汤中最低（12.61 mg/g）。4种猪骨汤中对滋味有贡献的氨基酸数量为：棒骨汤（11种）、扇骨汤（9种）、脊骨汤（6种）、肋排汤（5种）。其中，鲜味氨基酸相对质量分数最高为扇骨汤（18.99%），甜味氨基酸最高为脊骨汤（60.13%），苦味氨基酸最高为棒骨汤（33.39%）。

2）电子舌PCA和判别指数分析得出，差异最大的是棒骨汤和扇骨汤，差异最小的是肋排汤和扇骨汤。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.18.001

收稿日期：2015-08-21

基金项目：国家自然科学基金资助项目（31401604）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2014BAD04B06）

作者简介：赵静（1991—），女（汉），硕士，研究方向：食用香料化学及其应用。

*通信作者：张玉玉（1982—），女，博士，讲师，研究方向：食用香料化学及其应用。

Comparison of Free Amino Acids and Taste Characteristics in Different Kinds of Pig Bone Soup

ZHAO Jing，DING Qi，SUN Ying，CHEN Yi-ying，ZHANG Yu-yu*，SUN Bao-guo，CHEN Hai-tao
（Beijing Innovation Centre of Food Nutrition and Human Health，Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Key Labaratory of Flavor Chemistry，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

Abstract：In order to study the taste contribution of free amino acid in pig bone soup，the free amino acids were detected in rid soup，bar soup bone，chine soup and fan bone soup by automatic amino acid analyzer.The taste outline was analyzed by the electronic tongue.The results indicated that 17 kinds of amino acids were isolated from 4 pig soup，including 7 kinds of essential amino acids.The content of total free amino acids was the highest in the stick soup（24.65 mg/g），but the lowest in the rib soup（12.61 mg/g）.Only 2 kinds of umami amino acids were detected，but the relative amounts of the glutamic acid in the 4 soup were between 16.69%-19.96%，the TAV values were between 6.84-16.02，which was far higher than other free amino acids，and it had the greatest taste contribution in pig bone soup.The results of the electronic tongue showed that a significant difference taste outline was between the stick bone soup and the other three，but not in the other three kinds of pig soups.

Key words：pig bone soup；free amino acid；taste active value；electronic tongue；principal component analysis