基于谱效关系的α-糖苷酶抑制剂筛选方法研究

王利强，常春艳，娄婷婷，葛含光，王永芳，葛宝坤（天津出入境检验检疫局，天津300461）

基于谱效关系的α-糖苷酶抑制剂筛选方法研究

王利强，常春艳，娄婷婷，葛含光，王永芳，葛宝坤
（天津出入境检验检疫局，天津300461）

摘要：采用以生物活性色谱为基础的谱效筛选模式，以减肥茶为研究对象，首先确认了该减肥茶对α-糖苷酶有较强的抑制活性；进一步建立了α-糖苷酶抑制剂筛选模型，并与液相色谱串联质谱相结合，对减肥茶进行谱效关系分析，从中筛选到7个对α-糖苷酶有较强的抑制活性的化合物，通过质谱进行结构鉴定。这7个化合物分别为儿茶素、儿茶素没食子酸脂、芦丁、2-羟基-1-甲氧基阿朴啡、槲皮素、荷叶碱和大黄素；最后对这7个化合物进行活性验证。建立的基于谱效关系分析对α-糖苷酶抑制剂的筛选和鉴定的方法简单、快速、准确率高。可用于对天然产物等复杂体系中活性物质的快速筛选和鉴定。

关键词：谱效关系；筛选体系；α-糖苷酶抑制剂；减肥茶

天然产物资源具有巨大的经济价值和应用价值，许多天然产物中含有活性功能的化合物。对天然产物活性成分的研究也是功能食品研究的重点[1-2]。而针对成分复杂的天然产物，建立一种快速高效的筛选和鉴定体系是提高天然产物研究效率的关键问题。谱效关系研究是近年来兴起的将指纹图谱与药效研究相结合的一种研究方法，常用于天然产物中活性成分靶向性筛选[3]。生物活性色谱技术是研究谱效关系重要方法，生物活性色谱将天然产物的成分分离、鉴定和药效活性评价等步骤在一个体系中完成。相对于传统方法，生物活性色谱可以极大提高活性物质筛选的速度和效率，降低传统天然产物活性成分开发的成本[4-5]。

α-糖苷酶是人体内将淀粉逐级水解和消化，最终转化为葡萄糖为人体提供能量的关键酶。研究表明，抑制α-糖苷酶的活性，降低淀粉的消化吸收速率是一种有效的控制体重和减肥的手段之一[6]。因此，以α-糖苷酶为作用靶点，筛选有效的α-糖苷酶抑制剂也成为减肥药物研发的重要方向之一[7]。天然产物种类繁多，资源丰富，经过几千年的时间和发展，也验证了一些有良好疗效的产物，在治疗肥胖症和减肥方面有很大的优势，如荷叶、莲子、桑枝、黄连、大黄等[8-10]。市售某品牌减肥茶由荷叶、决明子、乌龙茶、泽泻、苦丁茶、大黄、陈皮等七味中药为主要原料制成保健食品。经试验证明，具有减肥功能，受到市场的认可。但是该配方成分复杂，目前对其中的活性成分的研究并不全面，仅以槲皮素作为质量控制的指标成分。因此，需要全面对该产品中的活性成分进行分析和评价，可以更有效地进行产品质量控制和药理研究。

本研究采用以生物活性色谱为基础的谱效筛选模式，以该减肥茶为研究对象，首先从整体水平评价其对α-糖苷酶的抑制活性，进一步采用基于活性的液质联用筛选模型进行谱效关系分析，并鉴定其中有α-糖苷酶抑制活性的成分，最后对筛选到的活性成分进行活性验证。

1　试验部分

1.1试剂与仪器

市售某品牌减肥茶：中国；阿卡波糖：美国Sigma公司；人源α-糖苷酶：南开大学药学院提供；葡萄糖测定试剂盒：中生北控生物科技股份有限公司；甲醇、乙腈：美国Thermo-Fisher公司；其他试剂均为国产分析纯。

Q-Exactive质谱仪：美国Thermo-Fisher公司；Model 680酶标仪：美国，Bio-Rad；十万分之一电子天平：瑞士Mettler Toledo公司；高速离心机：德国Sigma公司；KQ3200型超声波清洗机：昆山市超声仪器有限公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司。

1.2方法

1.2.1样品制备

称取1.0 g减肥茶于试管中，加入10 mL100℃热水浸泡30 min，后经高速离心机8000 r/min离心10 min，取上清液待用。

1.2.2整体α-糖苷酶抑制活性评价

减肥茶对α-糖苷酶的抑制活性是通过对α-糖苷酶与底物麦芽糖的反应速度的影响来测定。在96孔板中加入10 μL 10倍系列稀释的样品溶液或者阳性药，加入100 μL 0.1%的麦芽糖溶液作为底物，在37℃的恒温培养箱中孵育5 min后，再向其中加入10 μL 2 U/mL的α-糖苷酶溶液启动反应，37℃的恒温培养箱中反应30 min，加入20 μL 1 mol/L的HCl终止反应。然后用葡萄糖氧化酶法测定反应中产生的葡萄糖的含量。取40 μL上述的反应液，向其中加入150 μL的葡萄糖工作液。37℃的恒温培养箱中反应15 min后，用酶标仪在490 nm条件下测定其吸光度值。通过统计软件Graphpad Prism 5的非线性回归方法来计算相应样品的IC50值，即抑制率达到50%时的抑制剂的浓度。

1.2.3谱效关系分析

取样品提取液（0.5 g/mL）用Q-Exactive液相色谱质谱仪进行活性成分的分离和结构鉴定。液相条件：Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流动相0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；二元梯度洗脱：0～15 min 5%～40%B，15 min～30 min 40%～100%B，30min～35 min100%B。流速为0.3mL/min；柱温：35℃；进样量：10 μL。样品溶液通过以上液相条件进行分离，分离后用96深孔板进行液相馏分的收集，每30 s收集到一个孔内。收集后的馏分在50℃的条件下减压干燥，剩余的物质用100 μL的0.1%的麦芽糖溶液充分溶解，再向其中加入10 μL 2 U/mL的α-糖苷酶溶液，37℃的恒温培养箱中反应30 min，加入20 μL 1 mol/L 的HCl终止反应。然后用葡萄糖氧化酶法测定反应中产生的葡萄糖的含量，方法同1.2.2。之后对活性成分进行质谱分析。质谱条件：电喷雾（ESI）离子源，正离子检测模式。扫描范围：m/z 100～1 500；分辨率：70 000；毛细管电压为3 kV；二级质谱碰撞能20 V。

1.2.4活性成分活性验证

根据谱效关系筛选到的活性物质，配制10倍系列稀释标准样品溶液。在96孔板中加入10 μL 10倍系列稀释的单体物质溶液，加入100 μL 0.1%的麦芽糖溶液作为底物，在37℃的恒温培养箱中孵育5 min后，再向其中加入10 μL 2 U/mL的α-糖苷酶溶液启动反应，37℃的恒温培养箱中反应30 min，加入20 μL 1 mol/L的HCl终止反应。然后用葡萄糖氧化酶法测定反应中产生的葡萄糖的含量。通过统计软件Graphpad Prism 5的非线性回归方法来计算相应样品的IC50值。

2　结果与讨论

2.1整体α-糖苷酶抑制活性评价

针对减肥茶进行α-糖苷酶抑制剂的筛选，考虑到该减肥茶的日常使用方法是热水浸泡后引用，因此，为了更加接近实际，选用热水浸泡方式进行提取。目前，市售的α-糖苷酶主要是从酵母、鼠和猪体内提取得到，为了使活性评价结果更为准确，选取南开大学药学院实验室成功表达的人源α-糖苷酶。样品对α-糖苷酶的抑制曲线见图1。

由图1可知，减肥茶溶液对α-糖苷酶抑制的IC50值为15.19 mg/mL，而阳性药阿卡波糖对α-糖苷酶抑制的IC50值1.112 μg/mL，即15.19 mg/mL的减肥茶提取液就能达到与阿卡波糖1.112 μg/mL相当的抑制效果。考虑到阿卡波糖对α-糖苷酶有极强的抑制作用，因此该减肥茶提取液对α-糖苷酶有较强的抑制作用，该减肥茶中含有α-糖苷酶抑制剂成分，可以对减肥茶中的活性成分进行进一步的筛选和鉴定。

图1　减肥茶提取物和阿卡波糖对α-糖苷酶的抑制曲线Fig.1　Inhibition curve of the extract of slimming tea and acarbose against α-glucosidase

2.2谱效关系分析

减肥茶提取溶液经液相分离后，通过三通分流器分流，90%洗脱液收集于96孔板中用于α-糖苷酶抑制活性检测，其余10%进入质谱用于结构鉴定分析。其正离子模式总离子流图分别如图2A所示。按0.5 min/孔收集减肥茶提取溶液的UPLC流出液，共收集60段，测定每份流出液对α-糖苷酶的抑制活性，结果见图2B，其中的7段样品具有显著的α-糖苷酶的抑制活性，以1、2、3、4、5、6、7表示。通过Q-Exactive质谱对以上7段具有显著性NF-κB抑制活性的物质进行结构鉴定，其一级质谱及二级质谱信息见表1。

图2　减肥茶提取物的总离子流图和α-糖苷酶抑制活性图Fig.2　The TIC chromatography of extract of Slimming Tea and bioactivity chromatograms of α-glucosidase inhibition activity

由一级质谱（MS）测定可以得到物质的精确分子量信息，通过这些物质的精确分子量比对相关的文献报道及化合物库，推测各个物质的分子式，再根据二级质谱（MS/MS）中的碎片信息（表1），并结合每个单味药材中已报道的成分结构信息，推测物质可能的结构式。按照上述方法进行化合物结构解析，该减肥茶提取溶液筛选到的7个α-糖苷酶抑制剂分别是儿茶素、儿茶素没食子酸脂、芦丁、2-羟基-1-甲氧基阿朴啡、槲皮素、荷叶碱和大黄素。

表1　减肥茶中α-糖苷酶抑制剂的鉴定结果Table 1　MS/MS data and the identification results for the bioactive compounds in slimming tea

2.3活性成分活性验证

根据谱效关系分析，筛选到了儿茶素、儿茶素没食子酸脂、芦丁、2-羟基-1-甲氧基阿朴啡、槲皮素、荷叶碱和大黄素7种可能的α-糖苷酶抑制剂。考虑到谱效分析中对化合物的活性测定都是在单一浓度条件下进行的，可能会有一定的假阳性几率。因此，进一步测定这些化合物对α-糖苷酶的抑制曲线，通过对α-糖苷酶抑制的IC50值对其抑制活性进行评价。结果显示见图3。

由图3可知，槲皮素的IC50为2.40 μg/mL，荷叶碱的IC50为3.43 μg/mL，儿茶素的IC50为4.47 μg/mL，2-羟基-1-甲氧基阿朴啡的IC50为18.85 μg/mL，儿茶素没食子酸脂的IC50为24.08 μg/mL，大黄素的IC50为37.55 μg/mL，芦丁的IC50为253.8 μg/mL。表明7种化合物对α-糖苷酶都有一定的抑制作用，槲皮素，荷叶碱和儿茶素对α-糖苷酶的抑制作用与阳性药物强α-糖苷酶抑制剂阿卡波糖的IC50（1.112 μg/mL）属于同一水平，也属于强α-糖苷酶抑制剂，2-羟基-1-甲氧基阿朴啡、儿茶素没食子酸脂、大黄素对α-糖苷酶的抑制作用次之，芦丁的抑制作用较弱。文献研究表明：槲皮素、荷叶碱、芦丁和2-羟基-1-甲氧基阿朴啡主要来源于减肥茶中荷叶[11]，儿茶素，儿茶素没食子酸酯主要来源于乌龙茶，苦丁茶和荷叶[12-13]，大黄素主要来源于决明子和大黄[14-15]。表明这几味药材是该减肥茶中α-糖苷酶抑制剂的主要来源，而该减肥茶配方中多数配料含有α-糖苷酶抑制剂，也说明表明抑制α-糖苷酶的活性，减少淀粉等碳水化合物的代谢也是该减肥茶的一个主要的作用机理。本研究建立的谱效筛选体系对α-糖苷酶抑制剂的筛选和鉴定的方法简单、快速、准确率高。本方法可以较好解决以往中药等复杂成分中活性成分筛选中需要药材量大，操作繁琐的问题。对于难以分离和含量较少的化合物也可实现高效筛选和鉴定。

图3　7种化合物对α-糖苷酶的抑制曲线Fig.3　Inhibition curve of the extract of seven compounds注：浓度单位为μg/mL。

3　结论

本研究采用以生物活性色谱为基础的谱效筛选模式，以市售某品牌减肥茶为研究对象，首先在整体水平上确认该减肥茶对α-糖苷酶有较强的抑制活性；进一步建立针对微量样品的α-糖苷酶抑制剂筛选模型，并与液相色谱串联质谱相结合，对该减肥茶进行谱效关系分析，从中筛选到7个对α-糖苷酶有较强的抑制活性的化合物，通过质谱进行结构鉴定，这7种化合物分别为：儿茶素、儿茶素没食子酸脂、芦丁、2-羟基-1-甲氧基阿朴啡、槲皮素、荷叶碱和大黄素；最后对这7种化合物进行活性验证。本研究建立的谱效筛选体系对α-糖苷酶抑制剂的筛选和鉴定的方法简单、快速、准确率高。可用于对天然产物等复杂体系中活性物质的快速筛选和鉴定。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.008

收稿日期：2015-09-01

基金项目:天津出入境检验检疫局科技计划项目（TK078-2013）

作者简介：王利强（1984—），男（汉），工程师，博士，研究方向：食品检测。

Study on Screening of the Effective Components for Inhibition α-Glucosidase Based on Chromatography-efficacy Relationship

WANG Li-qiang，CHANG Chun-yan，LOU Ting-ting，GE Han-guang，WANG Yong-fang，GE Bao-kun
（Tianjin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Tianjin 300461，China）

Abstract：The chromatography-efficacy relationship screening based bioactive chromatography was used for the research on slimming tea.The inhibition activity of the slimming tea against α-glucosidase was validated firstly.Then the α-glucosidase inhibitor screening method combined with HPLC-MS/MS system was established for the chromatography-efficacy relationship of slimming tea，seven compounds with α-glucosidase inhibition activity were obtained.The compounds structure were characterized as：catechin，catechingallate，rutin，2-hydroxy-1-methoxyaporphine，quercetin，nuciferin and emodin.The α-glucosidase inhibition activity of these compounds were comfirmed.The method for α-glucosidase inhibitor screening and identification based chromatography-efficacy relationship was simple，fast and with high accuracy.It can be used for the bioactivie compounds screening and identification in the complicated natral product.

Key words：chromatography-efficacy relationship；screening system；α-glucosidase；slimming tea