鱼肉蛋白质凝胶结构的保水机制研究

骆卢佳，陈凌，小川广男（.嘉兴职业技术学院农业与环境分院，浙江嘉兴34036；.东京海洋大学食品科学与技术学院，东京港区08-8477）

鱼肉蛋白质凝胶结构的保水机制研究

骆卢佳1，陈凌1，小川广男2
（1.嘉兴职业技术学院农业与环境分院，浙江嘉兴314036；2.东京海洋大学食品科学与技术学院，东京港区108-8477）

摘要：研究肌动球蛋白和肌球蛋白凝胶的结构以阐明鱼肉凝胶网状结构的保水机制。随着水分含量的增加，不管何种盐浓度条件下，在肌动球蛋白及肌球蛋白凝胶中，架桥点间平均分子量有所增加，相关长也呈现增加的趋势。当水分含量继续增加时，凝胶中的相关长开始减小。从扫描电子显微镜的结果中也可以看到类似的现象。此结果表明，在特定的水分含量中，不仅仅是构成凝胶结构的蛋白质分子链在伸长，同时预示着蛋白质分子链也有所开裂。

关键词：肌原纤维蛋白质；架桥；分子量；相关长

凝胶是指在分散介质中的胶体粒子或高分子溶质形成整体构造而失去了流动性，或胶体虽含有大量液体介质但处于固化的状态，是食品中一种较为常见的形态[1]。作为鱼肉主要成分的蛋白质，其最重要的功能特性之一就是凝胶化作用。而有关鱼肉蛋白质凝胶的研究，早在1939年就有人对凝胶的形成机制作了报道，另外从各种鱼肉凝胶的形成能[2-3]、蛋白质结构[4]、凝胶强度[5]等角度也展开了大量的研究。但是从鱼肉蛋白质凝胶中的水分着手的研究却寥寥无几。其中针对凝胶中水的存在状态有过除自由水外，同时存在结合能力不同的别种水的说法，后来利用压出法，吸出法等的测定，确认了3种不同存在状态的水[6]，并且随着温度的上升结合水有向游离水转变的趋势[7]。另外还利用了有关鱼肉肌原纤维蛋白质的水分吸附等温线[8]以及NMR观测了鱼肉蛋白质凝胶中水的状态[9]，近年来利用低场核磁共振（LF-NMR）法研究凝胶中的水分分布[10-11]也有被报道，因此有关凝胶中的水的解释以及肽链与水分子间的相互作用力，上述的研究都做了详细的介绍，但是鱼肉蛋白质凝胶是形成了怎样的结构来保持住水分的机制并不明确。

对于鱼肉蛋白质凝胶的结构解析之前曾利用橡胶弹性理论，但是用温度记录仪测定鱼肉蛋白质凝胶拉升时所产生的热时，温度在拉升过程中并没有上升；由应力缓和测定发现，鱼肉蛋白质凝胶随着温度的上升弹性率下降[12]，这一系列的试验表明其与橡胶的性质相反。那是由于鱼肉蛋白质凝胶中含有比较多的与凝胶形成无关的物质，这些蛋白质凝集物对压缩进行抵抗，弹性率的变化就显示出与橡胶相反的行为，利用橡胶弹性理论就有不合理性。所以将形成鱼肉蛋白质凝胶网状结构的部分和其他的凝集部分分离开来是必须的。构成凝胶结构的蛋白质为盐溶性蛋白质即为肌原纤维蛋白质，约占肌肉总蛋白质含量的40%～60%，为肌肉中含量最多也是最重要的蛋白质，其中肌球蛋白和肌动球蛋白是形成和改善鱼肉蛋白质凝胶弹性力的基本成分，而一些凝集的蛋白质也可以防止肌球蛋白的变性来强化凝胶的质构特性[13-14]，所以将凝集的蛋白质部分进行分离，关注肌球蛋白和肌动球蛋白凝胶的构造更为科学，而且对于鱼肉蛋白质凝胶的保水机制以此为出发点的研究还比较鲜见。

1　材料与方法

1.1材料与设备

冷冻鱼糜（SA级，Theragra chalcogramma）：阿拉斯加产；所有试剂均为分析纯。

HAAKE RS-50动态流变仪：德国哈克公司；DLS-7000光散射光度计：日本大塚电子有限公司；Quanta250环境扫描电子显微镜：美国FEI公司。

1.2肌原纤维蛋白质的提取

根据Ojima[15]的方法从冷冻鱼糜中提取肌原纤维蛋白质。

1.3肌原纤维蛋白质的确认

利用SDS-PAGE电泳法对是否为目的蛋白质进行确认。分别称取0.4 g的肌动球蛋白和肌球蛋白，加入7.5 mL的8 mol/L尿素-2%SDS-2%2-mercaptoethanol-0.02 mol/L Tris-HCl（pH 8.0）溶液煮沸，室温下溶解24 h。之后进行离心分离（11 000 r/min，15 min）得到的上清液在0.1%SDS-0.01mol/L Tris-HCl（pH 6.8）溶液中透析24 h，然后根据Laemmli的方法进行电泳。电泳结束后，浸在0.05%CBB-10%醋酸-50%甲醇的染色液中室温染色，之后加入10%醋酸-10%甲醇的脱色液进行脱色，直到看到清晰的显色带。

1.4动态黏弹性测定

在肌球蛋白及肌动球蛋白中添加冷却的蒸馏水，使其水分含量达到目的含水率（89%～93%），同时添加NaCl使盐浓度分别达到5%及10%，将得到的黏稠体进行充填，然后80℃加热30 min后，放入冰水中冷却10 min，最后置于5℃的冷藏室保存24 h，得到肌动球蛋白凝胶和肌球蛋白凝胶样品。

利用动态流变仪（Rheostress RS-50 HAAKE）进行流变特性测定。将样品凝胶制成厚度为1 mm的薄片，模具选用平板及PP35的探头，频率为1.00Hz，从20℃升温至80℃，升温速度为1.0℃/min，测定储能模量G’。

1.5动态光散射测定

动态光散射是从粒子在溶液中并行运动，回转运动，布朗运动使其位置发生变化的现象中测得的有关分子运动的情报中得到扩散系数，流体学半径等要素的方法。为求得相关长（分子链与分子链之间相互作用的距离），利用光散射光度计DLS-7000（大塚电子有限公司）进行动态光散射测定，经测试可知肌动球蛋白凝胶与肌球蛋白凝胶的粒径在5 μm以上的范围，因而决定利用T.D.法（Time Domain）进行了测定。测定的光源设定为He-Ne激光（波长632.8 nm），测定温度为（25±5）℃，测定角度为90°。

1.6肌原纤维蛋白质凝胶结构的观察

与1.4相同的方法制备肌原纤维蛋白质凝胶，其最后的水分含量为91%～94%。制成圆柱形后保持在30℃的条件下浸置于丙酮和t-丁醇的混合液（体积比1∶1）中2 h，然后将浸置液替换为t-丁醇，由于t-丁醇的凝固点为25℃，所以取少量浸没样品后放置于冷藏室冻结。然后，置于冻结干燥装置（JFD-310）的样品室中，为了防止冻结的样品融化，冷却至-8℃后，样品室进行排气，干燥24 h。干燥后的凝胶用于环境扫描电子显微镜（FEI公司制、Quanta250）的样品。样品放置于温度10℃，湿度100%，真空度1 200 Pa左右的样品室内观察，观察时电压设为20.0 kV，束斑为5.0。

1.7数据处理及分析

利用统计分析软件（SAS Institute Inc.，Cary，NC）和origin 8进行数据处理和分析。

2　结果

2.1肌原纤维蛋白质的确认

肌原纤维蛋白质为肌球蛋白和肌动蛋白。肌球蛋白是肌原纤维粗丝的组成单位，由两条分子量约为220 kDa的重链和分子量约为20 kDa的四条轻链组成。肌动蛋白是微丝的结构蛋白，分子量约为42 kDa的球状蛋白质。因此利用SDS-PAGE实验确认肌原纤维蛋白质，SDS-PAGE结果见图1。

200 kDa的区域呈现出蛋白区带，说明此为肌球蛋白重链，而在40 kDa的区域出现蛋白区带可以确认其为肌动蛋白。

2.2肌原纤维蛋白质凝胶的架桥点间平均分子量

肌原纤维蛋白质凝胶弹性在此被看作为橡胶弹性[16]，所以保水性高，具有弹性的蛋白质凝胶的构造依存于架桥点密度，架桥点间平均分子量，架桥点间距离，架桥点间分子链的柔韧性等因素[17]。估算凝胶网孔大小的时候可以通过储能模量来确定架桥点间平均分子量。储能模量可以体现聚合物链的振动以及聚合体的结构，而本次研究中，将凝胶中相互缠绕的点假设为架桥点，而其弹性决定于储能模量。因此，架桥点间平均分子量能在非晶态聚合物的橡胶弹性理论公式中测算出来，公式如下：

其中：ρ为密度，kg/m3；φ为聚合物的体积分数；R为气体常数；T为绝对温度，K；Me为分子量。

不同水分含量及盐浓度对肌动球蛋白凝胶与肌球蛋白凝胶的架桥点间平均分子量的影响见图2、图3。

图1　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图Fig.1　SDS-PAGE

图2　肌动球蛋白凝胶的架桥点间平均分子量与水分含量的关系Fig.2　Relationship between the water content and the molecular weight between the cross-linking points of actomyosin gels注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

从图3可知，随着水分含量的增加，肌球蛋白凝胶的架桥点间平均分子量也随之增大。特别是盐浓度为5%，水分含量超过91%的样品中，架桥点间平均分子量显著增大。这个结果表明，随着水分含量的增加，凝胶结构中的网状分子链的距离增大，另外，盐浓度低会使肌原纤维膨胀，提高了表面积，暴露了更多的大分子蛋白来结合水分[18]，而高浓度会使肌原纤维中肌球蛋白尾部的α螺旋结构不稳定，螺旋结构折叠，空间结构变小[19]。同时盐浓度增加，离子强度增大，离子键使网状结构相对稳定，因而离子强度较低的盐浓度为5%的凝胶在一定的水分含量处架桥点间平均分子量比盐浓度为10%的大。肌动球蛋白凝胶也表现出类似的趋势，但是当水分含量接近92%时，架桥点间平均分子量开始减小，这可能是在这个范围已不能形成强固的凝胶。

图3　肌球蛋白凝胶的架桥点间平均分子量与水分含量的关系Fig.3　Relationship between the water content and the molecular weight between the cross-linking points of myosin gels注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

2.3肌原纤维蛋白质凝胶分子链间的相关长

动态光散射技术根据光子相关原理，检测因布朗运动而产生的散射光强的涨落，从而得到散射质点动态行为的信息[20]。其中散射电场的一次相关系数由下式表示

这里g(1)（τ）为静电场的相关系数；β为定数；D为扩散系数，cm2/s；τ为弛豫时间，μs；q为静电场的强度。q可由下式表示

式中：n为溶剂的折射率；λ0为入射光的波长，nm。

在凝胶中网孔状的分子链与分子链间能相互影响的距离为相关长。上述的D扩散系数适用于爱因斯坦·斯托克斯式表示如下

式中：T为绝对温度，K；η为溶剂的黏度，Pa·s；ξ为相关长（架桥点间距离），nm；KB为波尔兹曼定数。

各水分含量及不同盐浓度下肌动球蛋白凝胶分子链间相关长的变化见图4。

盐浓度为5%和10%的肌动球蛋白凝胶的相关长都随着水分含量的增加而增加。另外，盐浓度为5%的凝胶中，水分含量达到94%时，相关长减小。这预示着分子链开裂，从而显现出的相关长减小。对于盐浓度为10%的凝胶，水分含量即使不断增加相关长仍旧没有减小。这说明由于肌原纤维蛋白质的浓度高，蛋白质分子链密度大，使得相关长开始减小的现象延迟，随着水分含量的继续增加，可以预想相关长也会有减小的趋势。

图4　肌动球蛋白凝胶的相关长与水分含量的关系Fig.4　Relationship between the moisture and the correlation length of actomyosin gels注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

不同水分含量与盐浓度的条件下，肌球蛋白凝胶分子链间相关长的变化见图5。

图5　肌球蛋白凝胶的相关长与水分含量的关系Fig.5　Relationship between the moisture and the correlation length of the myosin gels注：不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

从图5看出水分含量增加到92%时，相关长也随之增加，当水分含量超过92%，相关长开始减小。这有可能是形成网状结构的分子链开裂达到均一的状态所致。对相同水分含量条件下的凝胶进行比较，盐浓度10%的肌球蛋白凝胶的相关长比盐浓度为5%的小。这是由于盐溶性的蛋白质浓度越高，使得形成凝胶结构的分子链的密度越大。这个变化趋势和架桥点间平均分子量的变化一致。

2.4肌原纤维蛋白质凝胶的结构

利用环境扫描电子显微镜观察所得的图像见图6、图7。

图6为各水分含量下盐浓度为10%的肌动球蛋白凝胶的图像。可以看到随着水分含量的增加，其网孔有所增大，结构有显现出均一化的趋势。而从架桥点间平均分子量的结果推测水分含量接近92%时已不能形成强固的凝胶，故此时看到的结构中有部分分子链可能并没有形成架桥。图7为不同水分含量下盐浓度为10%肌球蛋白凝胶的图像。可以看到当水分含量增加到92%时，凝胶结构中的空间变大，当水分含量继续增加时，网状结构开始变密并渐渐不再清晰。

图6　不同水分含量下肌动球蛋白凝胶的环境扫描电镜图（×1 000）（盐浓度10%）Fig.6　The micrograph（ESEM×1 000）of actomyosin gels at different moisture（10%salted）

图7　不同水分含量下肌球蛋白凝胶的环境扫描电镜图（×1 000）（盐浓度10%）Fig.7　The micrograph（ESEM×1000）of myosin gels at different moisture（10%salted）

3　结论

通过对肌原纤维蛋白质凝胶保水机制的研究发现，随着水分含量的增加，架桥点间平均分子量也表现出增大的倾向，同时，伴随着水分含量的增加，相关长也随之增加，达到一定的水分含量时，凝胶的相关长开始减小。这也预示着分子链的伸长以及在一定的水分含量领域中分子链开裂而变得均一化。另外从低真空扫描电子显微镜的图像看来，在特定的水分含量处，凝胶的网状结构中不仅仅是分子链的伸长，构成网状结构的分子链也有所开裂，使得可见的纤维密度增加，导致结构产生变化。

综上所述，凝胶的保水机制为在共价键没有被破坏仍旧保持凝胶结构的前提下，随着水分含量的增加，通过凝胶网孔的增大以及分子链的开裂而得以锁住水分。如果能够把握使构造发生变化的水分含量，通过上述的结果，便有可能计算出构成网状结构的分子链开裂的条数，继而构建出蛋白质凝胶结构的模型。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.009

收稿日期：2015-11-03

作者简介：骆卢佳（1984—），女（汉），讲师，博士，研究方向：食品物性学。

Research on the Water Retention Mechanism of Fish-meat Gel

LUO Lu-Jia1，CHEN Ling1，Ogawa Hiroo2
（1.College of Agriculture and Environment，Jiaxing Vocational Technical College，Jiaxing 314036，Zhejiang，China；2.College of Food Science and Technology，Tokyo University of Marine Science and Technology，Minatoku 108-8477，Tokyo，Japan）

Abstract：To elucidate the structure of the network from the water retention mechanism of fish-meat gel，the gel structures of actomyosin（AM）and myosin（M）were investigated.In the AM and M gels，when the moisture content increased，the molecular weight between the cross-linking points（Me）and the correlation length also increased，regardless of the salt concentration.When the moisture content continued to increase，the correlation length of gels began to decrease.From the micrographs of gels could be seen the similar phenomenon.This result suggested that in a certain moisture content，the size of the network was enlarged and the network chains were also cleaved.

Key words：myofibrillar protein；cross-linking；molecular weight；correlation length