超声波预处理葵花籽粕蛋白制备抗氧化多肽的研究

董聪，李芳，王琳，罗丰收，朱俊雅，孔令明，*（.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐83005；.新疆轻工职业技术学院，新疆乌鲁木齐8300）

超声波预处理葵花籽粕蛋白制备抗氧化多肽的研究

董聪1，李芳2，王琳1，罗丰收1，朱俊雅1，孔令明1，*
（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052；2.新疆轻工职业技术学院，新疆乌鲁木齐830021）

摘要：以葵花籽粕蛋白粉为原料，利用超声波对其进行预处理，采用碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶为酶制剂对葵花籽粕蛋白进行酶解，以抗氧化性为指标，通过单因素及响应面法对预处理条件进行优化，获取最佳预处理工艺。结果表明，葵花籽粕蛋白质的超声波最佳预处理工艺为：超声波时间25 min、超声波功率187.5 W、超声波温度40℃。在此条件下，葵花籽粕多肽对超氧阴离子自由基（O2-·）和羟基自由基（·OH）清除能力分别为67.11%和52.47%。

关键词：超声波预处理；葵花籽粕蛋白；多肽；抗氧化活性

新疆地处欧亚大陆中部，光照资源丰富，干旱少雨，昼夜温差大，适宜向日葵的生长同时是向日葵的主产区，目前全疆每年向日葵的种植面积在10万亩左右，年产葵花籽25.39万t[1]。

葵花籽粕是葵花籽制油的副产物，葵花籽粕营养物质丰富，含29%～43%的优质的植物蛋白[2]，且氨基酸组成均衡。葵花籽粕中还含有大量的类脂、碳水化合物、还原糖、灰分[3]及大量的钙、磷和烟酸[4]等。

葵花籽粕蛋白质具有很好的蛋白特性，经过适当酶解可制备生物活性多肽如抗氧化剂、ACE抑制剂、抗疲劳剂抗癌剂及抗菌剂等[5]，已有的研究表明，葵花籽粕多肽具有较高的抗氧化剂抗高血压活性[6]。抗氧化活性肽因具有较强的抗氧化活性和很高的安全性，故可作为具有抗氧化作用的食品添加剂或直接作为保健食品应用于食品工业[7]。但目前，葵花籽加工仅限于榨油和制作炒货食品，而葵花籽粕多用作牲畜饲料或者直接抛弃，这不仅造成了极大的资源浪费而且还污染环境，对于其的精深加工后的经济价值值得人们重视。

超声波具有空化作用，可以在瞬间产生较强的机械剪切力，使蛋白质构象改变，促使其亲水基团暴露出来的更多[8]，有利于蛋白质底物和酶结合，提高酶解效率。本研究对超声波预处理双酶酶解葵花籽粕蛋白制备抗氧化活性多肽工艺进行优化，从而提高葵花籽粕利用率及创造更高的经济价值。研究成果将为葵花籽综合利用及开发功能性食品提供科学数据和参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

葵花籽粕蛋白：新疆农业大学食药学院实验室自制；碱性蛋白酶及木瓜蛋白酶：购于南宁庞博生物工程有限公司；无水乙醇、邻菲罗啉、邻苯三酚：购于天津市化学试剂三厂；氢氧化钠：购于天津市福星化学试剂厂；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸亚铁、过氧化氢30%，等：购于天津市光复科技发展有限公司。

1.2仪器与设备

全数字超声波发生器：武汉嘉鹏电子有限公司（额定功率250 W）；电热恒温水浴锅：北京市永光明医疗仪器有限公司；雷磁PHS-3C：上海仪电科学仪器股份有限公司；AL204-1C型电子天平：上海梅特勒托利多仪器有限公司；TD5A-WS台式低速离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；TU-1810紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3试验方法

1.3.1超声波辅助酶解葵花籽粕蛋白工艺流程

葵花籽粕蛋白→悬浮液→超声波预处理→调pH→水浴酶解→灭酶→离心→取上清液→测定抗氧化能力

1.3.2抗氧化能力的测定

·OH清除能力的测定：采用邻二氮菲-Fe2+氧化法[9]；O2-·清除能力的测定：采用邻苯三酚方法[6]。

1.3.3单因素试验

选用碱性蛋白酶（酶活力为2.265×10-3kat/g）及木瓜蛋白酶（酶活力1.674×10-3kat/g）为酶制剂，在时间为190 min、pH为7.6、复合酶（碱性蛋白酶：木瓜蛋白酶）比例为2.5∶1（质量比）、[E]/[S]为2%、底物浓度为2%、温度为50℃的酶解条件下，以抗氧化能力为指标，确定超声波预处理葵花籽粕蛋白的最佳功率[10]、温度[11]、时间[12]条件。

1.3.4响应面优化试验

在超声波功率（X1）、超声波时间（X2）、超声波温度（X3）单因素试验的基础上，以羟基自由基清除率和超氧阴离子自由基清除率为指标，以超声波功率、超声波时间、超声波温度为试验因素，进行三因素三水平响应面试验，对超声波辅助复合酶解工艺进行优化。因素水平表如表1所示。

表1　试验因素水平表Table 1　Test factor and level table

2　结果与分析

2.1单因素试验结果与分析

2.1.1超声波预处理功率对葵花籽粕多肽抗氧化能力的影响

在超声波温度为40℃、超声波时间为20 min、超声波功率分别为0、62.5、125、187.5、250 W的条件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力如图1所示。

由图可知超声波功率在0%～75%范围内时，抗氧化能力随超声波功率的增加而增大，在超声波功率为187.5 W时，超氧阴离子自由基和羟基自由基清除能力均达到最大值，分别为57.71%和39.38%。超声波功率大于187.5 W后，抗氧化能力并没有随功率的增加而增大，可能是因为功率较大致使蛋白质变性，故确定超声波功率为187.5 W。

2.1.2超声波预处理温度对葵花籽粕多肽抗氧化能力的影响

在超声波时间为20 min、超声波功率为125 W、超声波温度分别为30、35、40、45、50℃的条件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力如图2所示。

由图2可知超声波功温度在30℃～40℃范围内时，抗氧化能力随超声波温度的增加而增大，在超声波温度为40℃时，超氧阴离子自由基和羟基自由基清除能力均达到最大值，分别为61.63%和44.67%。超声波温度高于40℃后，抗氧化能力随超声波温度的增加而呈现下降趋势，说明超声波辅助酶解的温度不一定和水浴酶解的温度一致，故确定超声波温度为40℃。

2.1.3超声波预处理时间对葵花籽粕多肽抗氧化能力的影响

图2　超声波温度对抗氧化能力的影响Fig.2　Ultrasonic temperature effects the anti-oxidation

在超声波功率为125 W、超声波温度为40℃、超声波时间分别为10、15、20、25、30 min的条件下，葵花籽粕多肽抗氧化能力如图3所示。

图3　超声波时间对抗氧化能力的影响Fig.3　Ultrasonic time effects the anti-oxidation

由上图可知超声波功时间在10 min～25 min范围内时，抗氧化能力随超声波时间的增加而逐渐增大，在超声波时间达到25 min时，超氧阴离子自由基和羟基自由基清除能力均达到最大值，分别为58.07%和35.62%。超声波时间大于25 min后，抗氧化能力随超声波时间的增加而逐渐下降，可能是由于经过超声波的辅助水解使葵花籽粕蛋白质高度压缩、紧密的结构断开，长链打开，故抗氧化能力在较短时间内呈现升高的趋势，由此确定超声波时间为25 min。

2.2响应面试验结果与分析

根据上述单因素试验结果，利用Design Expert8.0软件进行响应面优化试验，如表2。

以超声波功率、时间、温度为响应变量，以超氧阴离子自由基清除率为响应值对表2进行方差分析，模型显著性及数据结果见表3。

表2　根据Design-erpert8.0设计响应面试验方案及结果Table 2　The test scheme and results according to design-erpery 8.0 design response surface

表3　模型方差分析及模型系数显著性检验Table 3　Model significant inspection and regression model analysis of variance

以超声波功率、时间、温度为响应变量，以羟基自由基清除率为响应值对表2进行方差分析，模型显著性及数据结果见表4。

表4　模型方差分析及模型系数显著性检验Table 4　Model significant inspection and regression model analysis of variance

利用Design-erpert8.0对结果进行回归分析，以超声波时间、超声波功率、超声波温度为响应变量，以超氧阴离子自由基清除率（Y1）和羟基自由基的清除率（Y2）为响应值的回归方程为：

由表3回归方差分析可知，模型R2=0.998 6说明回归方程有意义，F模型=496.08（P<0.000 1），模型极显著，失拟项F=0.020（P<0.05）结果不显著；由表4回归方差分析可知，模型R2=0.999 4说明回归方程有意义，F模型=1 853.55（P<0.000 1），模型极显著，失拟项F= 0.92（P<0.05）结果不显著，表3和表4说明试验结果误差较小拟合度较小，能较好的反应试验结果。

通过软件分析结果得出，葵花籽粕多肽对自由基清除率最佳条件为：超声波时间25 min、超声波功率187.5 W、超声波温度40℃。在此条件下，葵花籽粕多肽对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率分别为67.11%和52.47%。响应面优化结果见图4～图7。

图4　时间和温度对O·清除率影响的响应面图Fig.4　Response surface of time and temperature on the scavenging capacity of O·

图5　功率和温度对O·清除率影响的响应面图Fig.5　Response surface of power and temperature on the scavenging capacity of O·

图6　时间和功率对·OH清除率影响的响应面图Fig.6　Response surface of time and power on the scavenging capacity of·OH

图7　功率和温度对·OH清除率影响的响应面图Fig.7　Response surface of power and temperature on the scavenging capacity of·OH

3　结论

本文采用超声波预处理葵花籽粕蛋白后，再对其进行酶解得到葵花籽粕抗氧化活性多肽。比较葵花籽粕多肽对羟基自由基和超氧阴离子自由基的清除率，确定其最佳预处理条件。在单因素试验的基础上，通过响应曲面法获得最优预处理工艺为：超声波时间25 min、超声波功率187.5 W、超声波温度40℃。在此条件下，葵花籽粕多肽液对超氧阴离子自由基和羟基自由基的清除率分别为67.11%和52.47%。

参考文献：

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[6]赵涛.葵花籽粕中绿原酸和蛋白酶解肽的制备及生物活性研究[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2013:3-6

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.003

收稿日期：2014-07-24

基金项目：自治区科技支疆项目“葵花籽粕功能多肽高效制备技术研究与产品开发”（2013911070）

作者简介：董聪（1990—），女（汉），硕士研究生，研究方向：农产品加工及综合利用。

*通信作者：孔令明（1976—），男（汉），副教授，硕士生导师，研究方向：农产品加工及综合利用研究。

Ultrasonic Pretreat Protein of Sunflower Meal Preparation Antioxidant Peptides

DONG Cong1，LI Fang2，WANG Lin1，LUO Feng-shou1，ZHU Jun-ya1，KONG Ling-ming1，*
（1.College of Food and Pharmaceutics，Xinjiang Agricultural University，Urumqi 830052，Xinjiang，China；2.Xinjiang Institute of Light Industry Technology，Urumqi 830021，Xinjiang，China）

Abstract：Sunflower meal protein powder used as raw material，used ultrasonic to pretreated it，made alkaline protease and papain as enzyme preparation on sunflower meal protein hydrolysis.Optimized pretreatm process conditions by univariate and response surface method with antioxidant activity as an index，to obtain the best pretreatment processes.The results showed that the best sunflower meal protein ultrasonic pretreatment process：ultrasonic time 25 min，ultrasonic power187.5 W，ultrasonic temperature of 40℃.Under this condition，the scavenging of sunflower meal peptides on superoxide anion radical（O2-·）and hydroxyl radicals（·OH）were 67.11%and 52.47%.

Key words：ultrasonic pretreat；sunflower meal protein；peptides；antioxidant activity