黑布林皮中原花青素提取工艺的优化

龚玉石，何锦霞，郭　娟，侯方丽（广东药学院食品科学学院，广东广州510006）

工艺技术

黑布林皮中原花青素提取工艺的优化

龚玉石，何锦霞，郭娟，侯方丽
（广东药学院食品科学学院，广东广州510006）

摘要：测定了5种蔷薇科李属植物果实及其各组织中原花青素的相对含量。通过单因素试验分析提取温度、提取时间、料液比、提取溶剂、pH与抗氧化剂等因素对原花青素提取率的影响，在此基础上，采用L9（34）正交试验优选出原花青素提取的最佳工艺条件。结果表明：在这5种水果中，黑布林皮中原花青素含量最丰富，按料液比为1∶11（g/mL）的比例加入pH8的60%乙醇溶液于70℃提取50 min，干燥后的黑布林皮中原花青素的提取效率可达到8.95%。添加0.2%的抗氧化剂亚硫酸氢钠、抗坏血酸，新鲜黑布林皮中原花青素提取率分别提高了44.58%、15.52%。

关键词：黑布林皮；原花青素；提取

黑布林，黑李子被列为“五果”之首，含有大量的糖、维生素、矿物质、果酸、氨基酸、胡萝卜素等营养成分。医学界认为，黑李子具有去解郁毒，活血生津、消渴引饮，祛痰利尿、润肠等作用，能治好些疾病[1]。原花青素，是目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂之一，具有抗肿瘤、保护心血管、抗炎、抗辐射、预防高血压、美容等功能[2-3]，在食品、保健品、化妆品及医药等领域具有广泛的应用前景。

目前，国内外研究较多的是从葡萄籽[4-5]、松树皮[6-7]、蓝莓[8-9]、苹果[10-11]、莲科植物[12-15]等原料中提取原花青素，而有关黑布林原花青素的提取工艺的研究鲜见报道。在食品加工中，利用黑布林的果肉加工饮料、果酒、蜜饯等时，必定会有不少的皮渣废料产生，若能合理利用，必能减少企业的成本，而从皮渣中提取原花青素是一种较好的综合利用途径。本文比较了5种蔷薇科李属植物果实及其各组织中原花青素的相对含量，选择含量最高的黑布林皮作为实验原料，利用正交分析法优化出黑布林皮中原花青素的最佳提取条件，为黑布林皮原花青素的研究和应用提供参考，开拓了黑布林皮资源综合利用的有效途径。

1　材料与方法

1.1材料和试剂

黑布林：国产，购于广东省中山市五桂山长命水市场；原花青素标准品：上海金穗生物科技有限公司；香草醛：天津市福晨化学试剂厂；硫代硫酸钠、抗坏血酸、柠檬酸、亚硫酸氢钠、甲醇、硫酸、乙醇、氢氧化钠等均为分析纯。

1.2仪器设备

AEY-220电子分析天平：长沙高新开发区湘仪天平仪器设备有限公司；V-1200型紫外-可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；雷磁PHS-3C型PH计：上海精密科学仪器有限公司；烘干箱DGX-9053B-2：上海福玛实验设备有限公司；HH-2K8二列八孔智能水浴箱；巩义市予华仪器有限责任公司。

1.3方法

1.3.1样品的选择及确定

样品制备：将李子、黑布林、红布林、黄金李和苹果5种蔷薇科李属植物果实的果皮、果肉、果核分离，分别取0.2 g，并以料液比1∶10（g/mL）加入甲醇溶液，在55℃条件下提取60 min，过滤，定容至25 mL为样液，备用。

样品中原花青素含量的测定（硫酸-香草醛法[16-17]）：采用0.5 mL水代替0.5 mL样品，加入2.5 mL 30 g/L香草醛甲醇，2.5 mL 30%硫酸甲醇，在30℃下避光反应20分钟，作为空白调零。取0.5 mL样液于10 mL刻度试管中，加入2.5 mL 30g/L香草醛甲醇和2.5 mL 30%硫酸甲醇，30℃，避光反应20 min后，在500 nm处测定吸光值A1。由于提取液中存在的色素在500 nm处有吸收，因此，0.5 mL样品水溶液，加入2.5 mL香草醛甲醇，2.5 mL 30%甲醇，同样条件反应后，500 nm测定吸光值A0，以消除样品本底与颜色带来的误差，原花青素的吸光值为A=A1-A0。根据原花青素标准曲线计算含量。

1.3.2原花青素标准曲线及回归方程

准确称取经干燥的原花青素对照品5.2 mg（精确至0.000 1 g），用甲醇溶解，并准确定容至10 mL，制得浓度为0.52 mg/mL的标准溶液。再用甲醇稀释，配制成浓度为0、0.052、0.104、0.164、0.208、0.416、0.520 mg/mL的标准系列使用液。按照1.3.1中样品测定的方法，500 nm处测定吸光值。

1.3.3黑布林皮预处理

取新鲜黑布林皮，于40℃烘箱中烘干，然后用粉碎机粉碎，装棕色瓶避光低温保存备用。

1.3.4黑布林皮中原花青素的提取工艺优化

取一定量的黑布林皮粉末，置于10 mL容量瓶中，加入一定量，一定浓度的乙醇溶液，在一定温度的水中水浴一定的时间后，冷却定容，过滤，滤液备用。

分别考察不同提取剂种类及浓度、提取时间、提取温度、pH、料液比、提取次数、抗氧化剂种类对黑布林皮中原花青素提取率的影响。在单因素试验基础上，选取提取温度、提取时间、料液比及pH进行四因素三水平的正交试验，采用极差分析，以确定原花青素的最佳提取工艺条件。

1.3.5原花青素含量的测定

按照1.3.1中样品测定的方法，500 nm处测定吸光值，根据回归方程计算样品液中原花青素含量，再换算为原花青素提取率。原花青素提取率（%）按照公式（1）计算。

式中：X为黑布林皮中原花青素的提取率，%；m为根据回归方程计算样品液中原花青素的量，μg；M为用于测定的样品质量，mg；V1为待测样品溶液的取样体积，mL；V2为样品定容的体积，mL；d为样品溶液稀释倍数。

2　结果与分析

2.1原花青素标准曲线及回归方程

以吸光度为纵坐标，原花青素含量为横坐标，所得的标准曲线如图1。

图1　原花青素标准曲线Fig.1　The standard curve of the proanthocyanidins

其回归方程：y=2.864 0x+0.002 2，相关系数R2= 0.998 0，表明在所测的含量（0.000 mg～0.260 mg）范围内线性相关良好。

2.2样品的选择及确定

李子、黑布林、红布林、黄金李和苹果5种蔷薇科李属植物果实的果皮、果肉、果核中原花青素的含量结果如图2。

图2　不同水果的果皮、果肉、果核中原花青素的含量Fig.2　Proanthocyanidins content of pericarp，pulp and kernel from different fruit

由图2可知，各种水果其果皮中原花青素的含量较其本身的果肉及果核的原花青素含量要高。李子皮、黑布林皮中的原花青素含量相对其他果皮比较高，本试验选用黑布林皮作为原材料。

2.3黑布林皮中原花青素提取工艺的单因素试验

2.3.1不同提取溶剂种类及浓度对原花青素提取率的影响

取黑布林粉0.1g于10mL容量瓶中，分别以1∶10（g/ mL）的料液比加入不同浓度的甲醇、乙醇以及蒸馏水，在55℃条件下提取60 min，定容，过滤，取0.5 mL提取液测吸光值，根据标准曲线计算原花青素提取率，结果如图3所示。

图3　提取溶剂对原花青素提取率的影响Fig.3　Effect of extraction solvent on the extraction ratio of proanthocyanidins

由图3可知，60%的乙醇作为溶剂时，原花青素提取率最高。水为提取剂，原花青素提取率最低。纯甲醇的提取效果也很好，但甲醇有一定毒性，与乙醇相比也更容易挥发损失，所以选取60%的乙醇溶液作为后续的提取溶剂。

2.3.2提取温度对原花青素提取率的影响

取0.1g黑布林皮粉于10mL容量瓶中，再按1∶10（g/ mL）的比例加入浓度为60%的乙醇溶液，温度分别为30、40、50、60、70、80、90℃的情况下，水浴提取60 min，冷却后定容至刻度线，过滤，取0.5 mL提取液测吸光值，根据标准曲线计算原花青素提取率，结果如图4所示。

图4　提取温度对原花青素提取率的影响Fig.4　Effect of extraction temperature on the extraction ratio of proanthocyanidins

由图4可知，随着温度的增加，原花青素提取率呈现上升后又稍下降的趋势，其中在提取温度为50℃时，原花青素提取率最高。温度升高，分子运动加剧，原花青素的溶解度也加快，同时高温可引起细胞膜结构的变化，使原花青素更容易溶出，但当温度过高时，由于原花青素热稳定性差，结构被破坏，导致提取率降低。

2.3.3料液比对原花青素提取率的影响

取0.1g黑布林皮粉于10 mL容量瓶中，再按料液比分别为1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11、1∶12、1∶13、1∶14（g/mL）的比例加入浓度为60%的乙醇溶液，50℃水浴加热，水浴提取60 min，冷却后定容至刻度线，过滤，取0.5 mL提取液测吸光值，根据标准曲线计算原花青素提取率，结果如图5所示。

图5　料液比对原花青素提取率的影响Fig.5　Effect of material-liquid ratio on the extraction ratio of proanthocyanidins

由图5可知，随着料液比的增加，原花青素提取率呈现上升的趋势，在料液比为1∶11（g/mL）的时候达到最高，料液比继续增加，原花青素提取率逐渐下降。2.3.4提取时间对原花青素提取率的影响

取0.1 g黑布林皮粉于10 mL容量瓶中，再按1∶11（g/mL）的比例加入浓度为60%的乙醇溶液，50℃水浴加热，分别提取20、30、40、50、60、70、80 min，冷却后定容至刻度线，过滤，取0.5mL提取液测吸光值，根据标准曲线计算原花青素提取率，结果如图6所示。

图6　提取时间对原花青素提取率的影响Fig.6　Effect of extraction time on the extraction ratio of proanthocyanidins

由图6可知，随着提取时间的延长原花青素提取率先升高后降低，当提取时间为60 min时原花青素提取率达到最高。可能是因为提取时间太长，原花青素有效结构被破坏。

2.3.5提取次数对原花青素提取率的影响

取0.1g黑布林皮粉于10mL容量瓶中，再按1∶11（g/ mL）的比例加入浓度为60%的乙醇溶液，50℃水浴加热提取60 min，冷却，定容，过滤，滤液为第1次提取液。将滤渣转移至10 mL容量瓶中，用相同的条件进行第2、3、4次提取，分别得到第2次、第3次、第4次提取液，每次提取液各取0.5 mL测吸光值，根据标准曲线计算原花青素提取率，结果如图7所示。

由图7可知，对黑布林皮原花青素进行第1次提取时，提取率略占总提取率的86%以上，第2次、第3次、第4次分别占11%、1.8%、0.7%，说明在进行第1次和第2次提取时绝大部分的原花青素已经从黑布林皮中溶出，而第3次及第4次仅有极少量的原花青素可被提取，所以本试验提取2次即可。

2.3.6pH对原花青素提取率的影响

取0.1 g黑布林皮粉于10 mL容量瓶中，按1∶11 （g/mL）的比例加入浓度为60%的乙醇溶液，60%的乙醇分别用pH为4、5、6、7、8、9、10、11缓冲溶液配制，再50℃水浴加热提取60 min，冷却，定容，过滤，取0.5 mL测吸光值，根据标准曲线计算原花青素提取率，结果如图8所示。

图7　提取次数对原花青素提取率的影响Fig.7　Effect of extraction times on the extraction ratio of proanthocyanidins

图8　pH对原花青素提取率的影响Fig.8　Effect of pH value on the extraction ratio of proanthocyanidins

由图8可知，pH对原花青素提取率影响不大，pH大于10时，原花青素提取率下降。可能是因为原花青素不稳定，易氧化分解，长时间加热及强碱处理可破坏其有效结构，造成原花青素的大量损失。

2.3.7抗氧化剂对原花青素提取的影响

取0.1 g黑布林皮粉或者磨碎的新鲜黑布林皮于10 mL容量瓶中，按1∶11（g/mL）的比例分别加入60%的乙醇溶液，再分别添加0.2%的抗氧化剂抗坏血酸、柠檬酸、硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠，混匀，50℃水浴加热提取60 min，冷却，定容，过滤，取0.5 mL测吸光值，根据标准曲线计算原花青素提取率，结果如图9所示。

图9　抗氧化剂对原花青素提取率的影响Fig.9　Effect of antioxidant on the extraction ratio of proanthocyanidins

由图9可知，对于干燥后的黑布林皮，添加抗氧化剂后原花青素的提取率均低于没有添加抗氧化剂组，可能是因为添加抗氧化剂后抗氧化剂与水-乙醇分子结合，使原花青素与水-乙醇的结合机会降低，因此降低了原花青素的提取率。而对于新鲜的黑布林皮，抗坏血酸与亚硫酸氢钠的添加能提高原花青素的提取率，分别提高了15.52%与44.58%，提示，从新鲜的黑布林皮中提取原花青素时可以添加一定剂量的抗氧化剂亚硫酸氢钠或抗坏血酸。

2.4黑布林皮中原花青素提取工艺的正交试验

根据单因素试验的结果，选取提取温度、提取时间、料液比及pH进行四因素三水平的正交试验，采用极差分析，以确定原花青素的最佳提取工艺。

1）固定条件：提取剂为60%乙醇溶液，提取1次，避光进行显色反应，不添加抗氧化剂。

2）试验因素及水平选择见表1，正交试验结果见表2。

表1　因素水平表Table 1　The factor level

表2　正交试验方案与结果Table 2　Design and results of orthogonal test

由表2可知，对60%乙醇提取效果影响最为显著的为因子D，其次为因子A和因子B，因子C对提取效果影响较不显著，根据K值大小，提取的最佳条件是A3B2C2D3，即提取温度为70℃，提取时间为50 min，提取的料液比为1∶11（g/mL），pH为8。由于最优组合不在正交试验设计中，需要对最佳工艺条件做验证试验，验证试验得到最佳工艺条件的原花青素提取效率为8.95%，结果显示最优组合A3B2C2D3的原花青素提取效率高于正交试验中的任何一个组合。

3　结论

1）李子、黑布林、红布林、黄金李和苹果5种蔷薇科李属植物果实的果皮、果肉、果核相比较，黑布林皮中的原花青素含量最高，所以本试验选择黑布林皮为原材料。

2）优化得出干燥后的黑布林皮中原花青素提取的最佳工艺条件为：按料液比为1∶11（g/mL）的比例加入pH为8的60%乙醇溶液，于70℃水浴提取50 min，原花青素提取率可达8.95%。

3）从新鲜的黑布林皮中提取原花青素时，添加0.2%的抗氧化剂亚硫酸氢钠、抗坏血酸，分别使原花青素提取率提高44.58%、15.52%。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.014

收稿日期：2015-02-05

作者简介：龚玉石（1980—），女（汉），讲师，博士，研究方向：天然产物化学与功能性食品。

Study on Optimization of Extraction of Proanthocyanidins from Black Plum Peel

GONG Yu-shi，HE Jin-xia，GUO Juan，HOU Fang-li
（School of Food Science，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Abstract：Concentration of proanthocyanidins in different organizations of five rosaceae plants of the genusli fruit was determined..Through single factor experiment，the influences of extraction temperature，extraction time，solid-liquid ratio，extraction solvent，pH and antioxidants on extraction ratio of proanthocyanidins from black brinpeelwerestudied.Basedonsingleextractingyield，aL9（34）orthogonalexperimentwascarriedouttodetermine the optimal extraction condition of proanthocyanidins.The results suggested that black brin peel had the most abundant proanthocyanidins among the five fruits and the optimum extraction conditions were determined as60% ethanolofpH8，solid-liquidratio1∶11（g/mL），70℃and50min.Themaximumyieldofproanthocyanidins indried blackplumpeelwas8.95%.Adding0.2%antioxidantssuchassodiumbisulfiteorascorbicacid，extractionratioof proanthocyanidinsfromfreshblackbrinpeelincreasedby44.58%and15.52%，respectively.

Key words：black plum peel；proanthocyanidins；extraction