女贞子中齐墩果酸提取工艺优化

郗艳丽，张啟娟，周　婧，都　耀，王舒然（吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132103）

女贞子中齐墩果酸提取工艺优化

郗艳丽，张啟娟，周婧，都耀，王舒然*
（吉林医药学院公共卫生学院，吉林吉林132103）

摘要：以女贞子中齐墩果酸的含量为评价指标，研究提取温度、料液比、回流次数对女贞子中齐墩果酸提取含量的影响，香草醛-高氯酸比色法测定其含量。在提取温度85℃，料液比1∶30（g/mL），回流5次的条件下，齐墩果酸的提取含量最高，可达到122.66 μg/mL，此时齐墩果酸提取率为4.066%。高效液相法验证提取物为齐墩果酸，此时齐墩果酸DPPH自由基清除率为70.96%。

关键词：女贞子；齐墩果酸；高氯酸-香草醛比色法；高效液相色谱法

女贞子在我国的大部分地方均可生长，且种植面积广，资源丰富，东北地区亦有大面积种植。其果实中含有多种活性物质，具有丰富的食用价值和极高的营养保健功效。研究证实，齐墩果酸是女贞子中的重要活性成分之一[1]。齐墩果酸对由自由基堆积引起的记忆减退、糖尿病、高血脂、肿瘤等疾病的防治效果明显[2-5]。此外，齐墩果酸的毒副作用小、安全性高，已成为医学、药学和食品保健科学的研究热点[6]。齐墩果酸的用途广，市场需求量大，从天然植物中提取的齐墩果酸更是供不应求[7]。因此，对齐墩果酸提取工艺的研究仍有非常重要的意义。本研究主要以女贞子为原料，通过对女贞子中齐墩果酸的提取和鉴定，建立了一种简便易行、低廉高效的齐墩果酸提取工艺，以满足对齐墩果酸的需求。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1材料与试剂

女贞子：购买自吉林市某药房；齐墩果酸标准品[标准品号为：GBW（E）100141]：购于中国生物制品研究所。

无水甲醇、乙酸乙酯、高氯酸、香草醛、氢氧化钠等试剂皆为分析纯，购于天津市大茂化学试剂厂；高效液相用甲醇为色谱纯，购于天津市永大化学试剂有限公司。

1.1.2仪器

202-1型电热恒温干燥箱：天津市泰森特仪器有限公司；CN-500A多功能中药粉碎机：中南制药机械厂；FA1104电子天平：上海精密科学仪器有限公司；索氏提取器：上海欣荣仪器有限公司；HHS型电热恒温水浴锅：上海博讯实业有限公司医疗设备厂；722型可见光分光光度计：上海菁华科技实业有限公司；RE-52A旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SHB-IIIA循环水式多用真空泵：上海豫康科教仪器设备有限公司；1260高效液相色谱仪：安捷伦；UV-1800紫外分光光度仪：日本岛津。

1.2工艺流程

1.2.1原料预处理

女贞子在60℃条件下干燥，多功能粉碎机粉碎，过40目筛，制成女贞子粉末，密封干燥储藏，备用。

1.2.2提取工艺

准确称取女贞子粉末，滤纸包成纸包置于索氏提取器中，加入甲醇溶剂进行回流提取，收集提取液于旋转蒸发仪中进行减压蒸馏，浸出膏用香草醛-高氯酸溶解并定容，加入乙酸乙酯终止反应，比色法测定浸出膏中齐墩果酸的含量。

1.3齐墩果酸标准曲线的绘制

1.3.1测定波长的选择

取齐墩果酸标准品5 mg置于洁净干燥试管中，加入5%香草醛冰醋酸和高氯酸混合液（1∶4，体积比）定容至20 mL，配成浓度为0.25 mg/mL的标准品使用液，紫外分光光度计在全波长范围内进行波谱扫描，在波长560 nm处获得最大吸收峰。

1.3.2标准曲线的绘制

取6支洁净干燥的试管，分别加入配制好的0.25 mg/mL标准品使用液0、1、1.5、2、2.5、3 mL于试管中，再分别加入5%香草醛冰醋酸和高氯酸混合液5、4、3.5、3、2.5、2 mL，充分摇匀，在70℃水浴下加热10 min，冷却至室温，迅速在各管中加入乙酸乙酯4 mL摇匀，即得齐墩果酸标准系列溶液，在波长560 nm波长下测其吸光度值，并以浓度（mg/mL）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标，绘制标准曲线，求得回归方程和相关系数（R2）。

1.4单因素试验

1.4.1提取温度对齐墩果酸提取含量的影响

准确称取女贞子粉末3 g，加入无水甲醇60 mL置于索氏提取器中，分别在80、85、90、95、100℃条件下进行回流提取。回流2次后取出冷却过0.22 μm孔径的滤膜，再经旋转蒸发至干得浸出膏，分别加入5%香草醛冰醋酸溶液和高氯酸混合液（1∶4，体积比）定容至10 mL，再加入乙酸乙酯终止反应，70℃水浴15 min，在波长560 nm下测吸光度，计算提取含量。

1.4.2料液比对齐墩果酸提取含量的影响

准确称取女贞子粉末1、1.2、1.5、2、3 g，加入无水甲醇60 mL置于索氏提取器中，90℃水浴温度下回流提取2次，取出冷却过0.22 μm孔径的滤膜，剩余步骤同“1.4.1”，计算提取含量。

1.4.3回流次数对齐墩果酸提取含量的影响

准确称取女贞子粉末3 g，加入无水甲醇60 mL置于索氏提取器中，90℃水浴温度下回流提取，回流次数分别为1、2、3、4、5次。提取结束后冷却过0.22 μm孔径的滤膜，剩余步骤同“1.4.1”，计算提取含量。

1.5正交试验

在单因素试验的基础上，以提取温度、料液比、回流次数为考察条件，每个因素选3个条件作为考察条件，并以L9（34）正交表进行正交试验，以提取含量为考察指标，筛选最佳提取条件，并按下列公式计算齐墩果酸的提取率。

提取率/%=（C/M×103）×100

式中：C为依据标准曲线计算出提取液中齐墩果酸含量，μg/mL；M为女贞子样品的质量，g。

1.6验证试验

1.6.1高效液相法鉴定提取样品

取齐墩果酸标准品2 mg，加入色谱甲醇溶液定容至10 mL，过0.22 μm孔径微孔滤膜，超声40℃、脱气20 min，手动进样，测定齐墩果酸标准品。提取液经旋转蒸发仪旋转蒸发至干，加入色谱甲醇定容至10 mL，其余处理方法同标准品。

高效液相色谱条件：色谱柱：DiamonsilC18（150 mm× 4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇：水为（16∶80，体积比）mL；检测波长：220 nm；流速：1.0 mL/min；室温；进样量：20 μL。

1.6.2DPPH自由基清除能力的测定

选取最佳提取条件提取齐墩果酸，旋转蒸发至干后加入95%乙醇充分溶解并定容至10 mL。取洁净干燥的试管4支，分别标记为0、1、2、3号，在0号管中加入95%乙醇3 mL，在1号管中按0.8∶5（体积比）的比例加入提取液及95%DPPH溶液，在2号管中加入相同比例的提取液及95%乙醇，在3号管中加入相同比例的95%乙醇及95%DPPH溶液，充分摇匀。37℃水浴30 min，冷却至室温，在517 nm波长下测定吸光度并计算清除率。

清除率（R）/%=[1-（Ai-Aj）/AC]×100

式中：Ac为不含DPPH的空白溶液吸光度；Ai为加入提取液后DPPH溶液的吸光度；Aj为没有加提取液的DPPH溶液吸光度。

2　结果与讨论

2.1齐墩果酸标准曲线的绘制

以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制齐墩果酸的标准曲线如图1。

图1　齐墩果酸标准曲线Fig.1　The standard curve of oleanolic acid determination

经线性回归分析得回归方程：Y=0.006 4X-0.127 2，R2=0.998 0，齐墩果酸在50 μg～150 μg范围内呈良好线性关系。

2.2单因素试验

2.2.1提取温度对齐墩果酸提取含量的影响

提取温度对齐墩果酸提取含量的影响结果见图2。

图2　提取温度对齐墩果酸提取含量的影响Fig.2　Effect of extraction time on oleanolic acid yield

提取溶剂的选择对提取时间有很大的影响。可供选择的提取溶剂有很多种，利用甲醇、乙醇或石油醚提取齐墩果酸的方法都有过报道[8-10]。其中石油醚毒性大，容易挥发，安全性低，不便于试验所用。乙醇沸点高，难以考虑低温条件对提取率的影响，而甲醇比乙醇沸点低，毒性比石油醚小，能满足试验要求。因此，选择甲醇为提取溶剂。此外，温度对齐墩果酸的提取也有很大影响。齐墩果酸具有很强的抗氧化活性[11]，对炎症反应也有抑制作用[12]，温度过高，会导致提取物活性的失活。适宜的提取温度，既会获得较高含量的齐墩果酸提取物，又能保护提取物的活性。

由图2可看出，随着提取温度的不断升高，齐墩果酸提取含量逐渐减小，提取温度为80℃时提取含量最大，85℃、90℃次之，95℃最低，但100℃时提取含量有所提高，但仍比90℃时的提取含量低，可能是温度过高导致齐墩果酸的结构被破坏，影响了提取的效果。

2.2.2料液比对齐墩果酸提取含量的影响

料液比对齐墩果酸提取含量的影响结果见图3。

图3　料液比对齐墩果酸提取含量的影响Fig.3　Effect of solid-liquid ratio on oleanolic acid yield

料液的比例会影响齐墩果酸的提取含量，合适的料液比会使女贞子粉末充分分散，接触有机溶剂，提高齐墩果酸的提取效率，降低溶剂的消耗，减少成本，同时也可以避免大量废弃的溶剂污染环境[13]。研究结果显示，当料液比为1∶20（g/mL）时，齐墩果酸提取含量最大。随着溶剂使用量的增大，提取含量反而下降，当料液比为1∶60（g/mL）时的提取含量最低。这一结果表明，大量使用溶剂不会获得高含量的齐墩果酸提取物，料液比为1∶20、1∶30、1∶40（g/mL）这3个条件下获得的齐墩果酸含量符合要求，因此这3个水平可以被列入正交因素的考查水平。

2.2.3回流次数对齐墩果酸提取含量的影响

回流次数对齐墩果酸提取含量的影响结果见图4。

图4　回流次数对齐墩果酸提取含量的影响Fig.4　Effect of reflux times on oleanolic acid yield

研究结果表明，回流次数与齐墩果酸的提取含量呈正相关，回流次数为3、4、5次时，获得的提取物中齐墩果酸的含量分别为88.82、96.76、121.53 μg/mL。回流次数越多，齐墩果酸提取物的含量越高。

2.3正交试验

在单因素试验的基础上进行正交试验，选取提取温度、料液比、回流次数为考察因素，每个因素选取3个水平以L9（34）进行正交试验，因素水平表见表1，以提取含量为考察指标，筛选最佳提取条件，结果见表2。

表1　齐墩果酸正交试验因素水平表Table 1　Level of orthogonal examination

由表2可知，极差的大小顺序为C＞B＞A，因此女贞子中齐墩果酸提取工艺影响因素的主次顺序也为C＞B＞A，即索氏提取的回流次数对提取含量影响最大，料液比次之，提取温度最小。最佳组合条件为A2B2C3，即提取温度为85℃，料液比为1∶30（g/mL），回流次数为5次，在此条件下，女贞子中齐墩果酸的提取含量为122.66 μg/mL，最优条件齐墩果酸的提取率为4.066%。

表2　正交试验结果Table 2　Result of orthogonal examination

2.4验证性试验

2.4.1高效液相法鉴定提取样品

高效液相法鉴定提取样品结果见图5。

高效液相色谱法检测结果表明，提取样品（如图5 中2所示）的出峰时间与齐墩果酸标准品（如图5中1所示）出峰时间相一致，进一步验证了提取样品的主要成分是齐墩果酸。

2.4.2齐墩果酸对DPPH自由基清除作用测定

加入样品后DPPH溶液的吸光度（Ai）为0.249，不含DPPH的空白溶液吸光度（Ac）为1.295，没有加样品的DPPH溶液吸光度（Aj）为0.168，计算求得DPPH自由基的清除率为70.96%。这表明提取物对DPPH自由基有明显的清除作用，这一结果与文献报道的一致[14]，可判断从女贞子中提取的物质是齐墩果酸。

图5　齐墩果酸标准品和提取样品色谱图Fig.5　HPLC chromatograms of oleanolic acid standard and extraction sample

3　结论

影响女贞子齐墩果酸提取含量的因素（提取温度、料液比和回流次数）中，回流次数为主要影响因素，料液比为次要影响因素，提取温度对提取含量的影响最小。通过正交试验得到了女贞子齐墩果酸的最佳提取工艺条件：提取温度85℃，料液比1∶30（g/mL），回流次数5次，在此条件下的齐墩果酸的提取含量为122.66 μg/mL，提取率为4.066%。通过高效液相色谱法和自由基清除率检测法进一步验证了提取物为齐墩果酸。试验结果表明，正交试验法能够优化女贞子齐墩果酸的提取工艺，获得较高纯度的齐墩果酸提取物。

参考文献：

[1]朱沛沛,杨鹏,郝欢,等.响应面法优化女贞子中齐墩果酸提取工艺的研究[J].杭州化工,2013,43(2):20-23

[2]吴勃岩,王雪,董静,等.齐墩果酸对S180荷瘤小鼠细胞色素C和Caspase-3表达的影响[J].中医药信息,2014,31(4):14-16

[3]Mapanga RF,Rajamani U,Dlamini N,et al.Oleanolic acid:a novel cardioprotective agent that blunts hyperglycemia-induced contractile dysfunction[J].Plus one,2012,7(10):e47322-e47322

[4]张琳琳,张素玲,张玉莲,等.齐墩果酸对快速老化小鼠海马神经元及APP/PS1基因表达的影响[J].中国老年学杂志,2014,34(21): 6089-6091

[5]Tsai SJ,Yin MC.Anti-oxidative,anti-glycative and anti-apoptotic effects of oleanolic acid in brain of mice treated by D-galactose[J]. European journal of pharmacology,2012,676(1/3):81-88

[6]何琨,张妍,张蓝可,等.齐墩果酸对小鼠成纤维细胞L929的影响[J].时珍国医国药,2013,24(2):281-283

[7]王巧云,李丙华,朱莉,等.齐墩果酸对氧化损伤模型人脐静脉内皮细胞的保护作用[J].中国药房,2014,25(43):4033-4035

[8] 周吴萍.丝瓜藤和叶中齐墩果酸的提取与含量分析[J].广西科技大学学报,2014,25(2):86-89

[9]黄新苹,可钰,冯凯,等.女贞子石油醚提取物的化学成分研究[J].中国药学杂志,2011,46(13):984-987

[10]李成,何义,陈灿,等.HPLC-MS法测定枣中的齐墩果酸和熊果酸[J].食品研究与开发,2013,34(15):75-77

[11]魏海珍,张秀峰.齐墩果酸对损伤血管内皮细胞的保护作用及其机制探讨[J].南京医科大学学报(自然科学版),2012,32(11):1505-1510

[12]Lee W,Yang EJ,Ku SK,et al.Anti-inflammatory effects of oleanolic acid on LPS-induced inflammation in vitro and in vivo[J].Inflammation,2013,36(1):94-102

[13]曹艳萍,杨秀利,薛成虎.红枣中齐墩果酸提取工艺的研究[J].食品科学,2007,28(10):165-167

[14]戴云,邱晓燕,何耀莹,等.齐墩果酸和熊果酸对DPPH自由基的清除作用[J].云南民族大学学报(自然科学版),2012,21(6):395-398

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.20.011

收稿日期：2015-01-08

基金项目：吉林省卫生计生委吉林省财政厅资助项目（2014ZC063）

作者简介：郗艳丽（1981—），女（汉），讲师，博士，从事食品毒理学研究。

*通信作者：王舒然（1968—），男（汉），教授，博士，从事食品营养学研究。

Study on Optimum Extraction Process of Oleanolic Acid from Ligustrum Lucidum Ait

XI Yan-li，ZHANG Qi-juan，ZHOU Jing，DU Yao，WANG Shu-ran*
（School of Public Health，Jilin Medical University，Jilin 132013，Jilin，China）

Abstract：With the content of oleanolic acid from ligustrum lucidum ait as evaluating indicator，the effect of extraction temperature，solid-liquid ratio and reflux times on the extraction content was considered.The contents of oleanolic acid were measured by vanillin-perchlorate colorimetry.The optimal extraction processes were as follows：extraction temperature of 85℃，solid-liquid ratio of 1∶30（g/mL）and reflux times of five.In these conditions，the extraction content of oleanolic acid was 122.66 μg/mL，and the extraction ratio was about 4.066%.Then the extraction was identified as oleanolic acid by HPLC method，and the scavenging rate of DPPH was 70.96%.

Key words：ligustrum lucidum ait；oleanolic acid；vanillin-perchlorate colorimetry；HPLC method