RunX2的真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

赵　明，范楚玲，郭　强，汪思应，李菲菲

RunX2的真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响

赵明，范楚玲，郭强，汪思应，李菲菲

摘要目的构建人RunX2真核表达载体，观察RunX2对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。方法运用逆转录PCR （RT-PCR）扩增、酶切、连接等基因重组技术将人RunX2基因插入pcDNA3．1真核表达载体中；并经酶切、PCR、测序鉴定；将构建的RunX2真核表达载体瞬时转染MCF-7细胞，利用Western blot法检测RunX2蛋白表达，用MTT实验和细胞划痕实验检测其对乳腺癌细胞的生物学影响。结果构建的RunX2真核表达载体在MCF-7细胞中高表达RunX2蛋白；发现高表达RunX2的MCF-7细胞活力增加，移动能力增强。结论构建的RunX2真核表达载体能促进乳腺癌细胞的增殖和迁移。

关键词RunX2；乳腺癌

2015-07-31接收

汪思应，男，教授，博士生导师，责任作者，E-mail：sywang ＠ahmu．edu．cn；

李菲菲，女，副教授，硕士生导师，责任作者，E-mail：349711832＠qq．com

RunX2是一种参与成骨分化和骨发育的重要转录因子［1］。在乳腺组织中，RunX2也参与某些基因的表达调控，在乳腺上皮细胞分化中发挥重要作用，并与乳腺肿瘤细胞株的侵袭性密切相关［2］。本课题组研究显示RunX2通过调节血管生成相关基因的表达促发乳腺癌细胞发生骨转移（待发表）。这一结果提示RunX2可能成为乳腺癌骨转移的一个标志物。为进一步探讨RunX2与乳腺癌侵袭转移的关系，该研究利用亚克隆技术构建人RunX2真核表达载体，并通过瞬时转染至乳腺癌细胞MCF-7中，以探讨RunX2对乳腺癌细胞的影响，初步了解其在乳腺癌侵袭转移中的机制。

1　材料与方法

1．1细胞系人乳腺癌细胞系MCF-7、MB-231细胞由本室长期保存。培养条件：配制含有DMEM、10%胎牛血清（FBS）、1%双抗（青霉素-链霉素）的完全培养基，将细胞置于37℃、5%CO2细胞培养箱培养。

1．2主要试剂和仪器根据NCBI Reference Sequence软件分析设计RunX2引物，引物由Invitrogen公司合成，PCR反应试剂、DNA限制性内切酶及DNA Marker购于TaKaRa公司，DMEM、胰酶、FBS均购于Gibco公司，Western blot相关试剂购于上海生物工程公司，RunX2抗体购于美国Abcam公司，PVDF膜购于Millipore公司。PCR仪为BIO-RAD公司产品。?

1.3PCR扩增提取人乳腺癌细胞MB-231的总RNA，以此为模板行RT-PCR扩增RunX2片段。引物：上游3′-CCG CTCGAG ATG GCA TCA AAC AGC CTC-5′；下游3′-TCC CCG CGG ATA TGG TCG CCA AAC AGA-5′（下划线部分为酶切位点）。PCR反应体系：25μl，变性温度98℃10 s，退火温度55℃5 s，延伸温度72℃10 s，反应35个循坏。PCR产物经1%的琼脂糖电泳发现一条1 kb左右的片段。回收酶切后经测序鉴定。

1.4人RunX2真核表达载体的构建将上述1 kb左右的片段回收酶切后用T4 DNA连接酶链接于pcDNA3．1真核表达载体，链接产物做小规模细菌转化，PCR及双酶切后经测序鉴定证实。

1.5pcDNA3.1-RunX2瞬时转染 MCF-7细胞1 ×106个细胞接种于90 mm平皿，待贴壁后长至70%密度时进行转染pcDNA 3．1-RunX2质粒10 μg、脂质体12μl与无血清opti-MEM混匀后轻覆细胞，转染6 h后换成含10%FBS的 DMEM培养48 h，加入细胞蛋白裂解液RIPA（97．5%PBS、1% NP40、0．5%脱氧胆酸钠、0．1%SDS）冰上裂解30 min，4℃离心取上清液，提取总蛋白（10μg／组）。经10%SDS-PAGE胶分离后，电转（200 mA、120 min）至PVDF膜上。膜用TBST（20 mmol／L Tris-HCl、pH 7．4，150 mmol／L NaCl，0．05%Tween 20）封闭，3 h后置于含抗 RunX2抗体（1：1 000）的TBST中4℃孵育过夜，再加入相应结合的二抗后与ECL发光检测剂结合显示结果。

1．6细胞生物学检测

1．6．1MTT法检测细胞活力将pcDNA3．1-RunX2真核表达质粒瞬时转染至MCF-7细胞中，促使细胞中的RunX2表达上调，通过MTT实验检测其细胞活力的变化，常规的消化、计数处于对数生长期的各实验组细胞，并将细胞接种于96孔板中，按照每孔2 000个细胞进行接种，每种细胞设置5个复孔。分别标记为0、24、48 h，共3块板，将96孔板放入培养箱中，待细胞贴壁后，取0 h的96孔板，在避光条件下加入MTT溶液后继续孵育，4 h后收取0 h的板，将上清液倒去，每孔加入DMSO溶解结晶，混匀，酶标仪检测550 nm处光密度（optical density，OD）值。第2天相同时间加MTT，收板后测OD值，以此类推。每组实验均重复3次。

1．6．2细胞划痕实验通过细胞划痕实验检测其细胞移动能力的变化，取6孔板于生物安全柜内操作，用直尺在每孔底部至少划三条线作为标记，然后消化对数期生长的细胞，接种于6孔板内，每孔约3 ×105个细胞。将6孔板放入细胞培养箱培养24 h，待细胞达到80%以上的融合率时，将细胞置于生物安全柜内操作。用20μl白枪头垂直于6孔板横线划痕，至少划三道痕。用PBS轻洗去划下的细胞，于相差显微镜下拍照，记为0 h。放入细胞培养箱中培养，每隔24 h，在同一位置拍照，以观察细胞的移动情况。每组实验重复3次。

2　结果

2.1构建人RunX2真核表达载体首先用逆转录PCR（RT-PCR）法得到RunX2的基因片段，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳发现一条1 kb左右的片段，见图1。将上述1 kb左右的片段回收酶切后用T4 DNA连接酶链接于pcDNA3．1真核表达载体，链接产物做小规模细菌转化，PCR及EcoRⅠ和SacⅡ双酶切后经测序鉴定证实，见图2。

2.2转染pcDNA3.1-RunX2的细胞高表达RunX2

pcDNA3．1-RunX2瞬时转染至低表达 RunX2的MCF-7细胞中，转染后48 h Western blot检测发现转染细胞中RunX2高表达，由图可以看出转染组中的RunX2蛋白表达高于未转染组。见图3。

2.3RunX2促进人乳腺癌细胞的活力及移动能力

将构建好的pcDNA3．1-RunX2瞬时转染至MCF-7细胞中，转染48 h后通过Western blot检测其转染效率，见图3。收集细胞，MTT法检测其细胞活力发现，与未转染组相比，转染组细胞活力明显增加。与未转染组相比，转染组增殖能力增加，差异有统计学意义（P＜0．001），见图4。通过划痕实验检测其移动能力发现，与未转染组相比，转染组的MCF-7细胞移动能力明显增加。与未转染组相比，24 h划痕内迁移细胞数目明显增加，差异有统计学意义（P＜0．01），见图5。

3　讨论

RunX2不仅调节成骨细胞分化，而且与乳腺癌发生骨转移密切相关［3］。RunX2通过调节血管生成相关基因的表达促发乳腺癌细胞发生骨转移。骨涎蛋白（BSP）与导管内转移性乳腺癌相关，可能在诱导乳腺癌细胞定向骨转移过程中发挥作用，骨桥蛋白（OPN）可以介导乳腺癌骨转移中肿瘤细胞与骨组织表面的连接，并且与骨转移中破骨细胞引发骨吸收活性增加相关。RunX2是骨髓间质干细胞成骨分化和骨发育的重要转录因子，它通过促进溶骨作用、肿瘤血管新生等多个途径转移癌细胞的生长［4-6］。RunX2已被证明在成骨与骨肉瘤的发生发展过程中起重要作用［7］。Runx2还被报道在临床预后差的乳腺癌中高表达［8］。最近，McDonald et al［9［10-13］显示，参与骨侵袭的几个基因，如血管内皮生长因子、基质金属蛋白酶（MMPs）、VEGF、OPN和BSP都是通过RunX2调节的，表明这个转录因子可能有助于乳腺肿瘤骨转移。这与本实验中提到的RunX2沉默降低转移性乳腺癌细胞系MB-231细胞的迁移和侵袭能力一致。此外，RunX2亦可调节MMPs家族中的其他基因，在MDA-MB-231中，利用小干扰RNA沉默RunX2表达可降低MMP-9的表达，并减弱癌细胞的侵袭能力，提示RunX2与乳腺癌转移密切相关［14］。

RunX2在乳腺癌的侵袭转移中的作用机制仍存争议。但是，在RunX2所表达的MDA-MB-231细胞株中，以上骨细胞分化效应并未出现。研究［15］表明，在MDA-MB-231细胞株中，RunX2调节 OPN基因的表达，并可持续激活BSP使其表达异常，抑制RunX2的表达可导致OPN和BSP的表达明显下调，提示RunX2在乳腺癌转移中发挥着重要作用。多数学者认为，RunX2能够调节一系列基因的转录进而影响乳腺癌细胞的侵袭能力，在乳腺癌发生骨转移的过程中起重要作用，且与其预后密切相关。

本研究构建的RunX2真核表达载体通过瞬时转染至乳腺癌细胞MCF-7中，并通过Western blot检测发现转染后的细胞高表达RunX2，说明成功构建了pcDNA3．1-RunX2真核表达载体。MTT实验证实过表达RunX2促进了细胞增殖，但是划痕试验中，划痕愈合是因为增殖促进划痕愈合还是因为过表达RunX2促进细胞迁移尚未明确，在后续的实验中，将通过Transwell实验进一步验证。

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Construction of RunX2 eukaryotic expression vector and study the proliferations and m igrations effective of RunX2 on breast cancer cells

Zhao Ming，Fan Chulin，Guo Qiang，et al
（Dept of Pathophysiology，Anhui Medical University，Hefei230032）

AbstractObjectiveTo investigate the biology effectof RunX2 gene after constructing the eukaryotic expression vector of human RunX2 in breast cancer cells．MethodsBy the recombinant techniques such as PCR amplification，digestion，ligation，the human RunX2 gene was inserted into the eukaryotic expression vector of pcDNA3．1，and then itwas identified by restriction enzyme digestion，RT-PCR，sequencing．Eukaryotic expression vector of human RunX2 gene was transiently transfected into MCF-7 cells．Western blot analysis was applied to detect the expression of RunX2 protein in breast cancer cellsMCF-7；MTT assay and wound healing assaywere used to detect the cells proliferation and invasion of MCF-7．ResultsOur result showed that the eukaryotic expression vector of RunX2 was highly expressed RunX2 protein in MCF-7 cells，the cell proliferation and migration abilities were enhanced in MCF-7 cells with high expression of RunX2 protein．ConclusionRunX2 constructs eukaryotic expression vector and promotesmalignant behavior of breast cancer cells．

Key wordsRunX2；breast cancer

中图分类号R 349．5

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1593-04

基金项目：国家自然科学基金（编号：81302319）

作者单位：安徽医科大学病理生理学教研室，合肥230032

作者简介：赵明，男，硕士研究生；