m iRNA-4465过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移侵袭的影响及其机制

骆广涛，王本忠

m iRNA-4465过表达对乳腺癌MDA-MB-231细胞迁移侵袭的影响及其机制

骆广涛，王本忠

摘要目的探讨miRNA-4465的过表达对乳腺癌MDAMB-231细胞迁移侵袭能力的影响及机制。方法将miRNA-4465的模拟物（minics）转染入MDA-MB-231细胞，通过实时定量PCR检测miRNA-4465的表达变化；运用Transwell实验检测转染后细胞迁移和侵袭能力的改变。采用生物信息学技术预测miRNA-4465的潜在靶基因，并通过荧光报告载体实验及Western blot加以证实。结果与阴性对照组相比，转染miRNA-4465 minics组miRNA-4465表达水平明显升高（P＝0．001）。Transwell迁移实验结果显示转染miRNA-4465 minics组细胞迁移能力减弱（P＝0．001）；Transwell侵袭实验结果显示转染miRNA-4465 minics组细胞侵袭能力降低（P＝0．010）。通过生物信息学技术预测了EZH2为miRNA-4465的潜在靶基因；荧光报告载体实验结果显示转染miRNA-4465 minics＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）后荧光素酶活性较转染阴性对照序列（NC）＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）降低66%（P＝0．001）。此外将miRNA-4465转染入MDA-MB-231细胞后EZH2蛋白表达降低。结论miRNA-4465能降低MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力，这个过程可能是通过调控EZH2基因的表达实现的。

关键词miRNA-4465；EZH2；乳腺肿瘤；转移

2015-07-31接收

王本忠，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：wangbenzhong2459＠126．com

乳腺癌发生远处转移是乳腺癌患者死亡的主要原因，因此研究乳腺癌转移的相关机制对于提高转移乳腺癌患者生存率和改善患者生活质量具有重要意义。微小RNA（microRNA，miRNA）已经证实能潜在促进或抑制乳腺癌转移［1］。近年来研究［2-4］表明，miRNA-26家族与多种肿瘤转移侵袭有关，如肺癌、肝癌及膀胱癌等。miRNA-26家族由miRNA-26a、miRNA-26b、miRNA-1297和miRNA-4465等 4个种子区序列相同（UCAAGUA）的miRNA组成。目前对于miRNA-26家族参与肿瘤转移侵袭的研究主要集中在miRNA-26a、miRNA-26b、miRNA-1297，而miRNA-4465在乳腺癌转移侵袭过程中的作用研究甚少。该研究拟通过将miRNA-4465 minics转染入具有高侵袭性的乳腺癌MDA-MB-231细胞，检测miRNA-4465对MDA-MB-231细胞迁移侵袭能力的影响，探讨其作用的分子机制。

1　材料与方法

1．1材料乳腺癌MDA-MB-231细胞由中国科学技术大学生命科学学院朱涛教授惠赠，细胞来源于美国模式培养物集存库；牛血清白蛋白（BSA）、胎牛血清、DMEM培养基及Opti-MEM培养基购自Gibco公司；Transwell小室购自Corning公司；Lipofectamine 2000购自 Invitrogen公司；miRNA-4465 mimics购自锐博公司；Matrigel胶购自BD公司；EZH2抗体购自Cell Signaling Tech公司，GAPDH抗体购自Abcam公司；质粒psiCHECK2及双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司；限制性内切酶Xho I、Not I及逆转录试剂盒购自Fermentas公司；DNA连接试剂盒及实时定量PCR试剂盒购自TaKaRa公司；DNA小抽及中抽试剂盒购自Axygen公司。

1．2方法

1．2．1细胞培养用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养 MDA-MB-231细胞，置于 5%CO2、37℃细胞培养箱中常规培养，根据细胞状态每隔2～3 d换新鲜培养基一次。

1．2．2实验分组根据转染情况将实验分为阴性对照组（NC组）及 miRNA-4465 minics转染组。转染试剂选用Lipofectamine 2000，转染步骤参考Lipofectamine 2000转染试剂说明书。

1．2．3实时定量PCR运用实时定量PCR检测转染miRNA-4465 minics至MDA-MB-231细胞后miRNA-4465的相对表达量。miRNA-4465 minics序列：5′-CUCAAGUAGUCUGACCAGGGGA-3′。首先 TRIzol法抽提细胞总RNA，再使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录合成cDNA。反应条件为42℃60min，70℃10 min。以逆转录得到的cDNA产物为模板，使用实时定量PCR检测miRNA-4465的相对表达量，每个样品设置2个复孔。内参照为U6。HsamiRNA-4465引物序列F：5′-CUCAAGUAGUCUGAC-3′，R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6引物序列F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，R：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。实时定量PCR反应条件如下：95℃预变性40 s，95℃变性5 s，60℃退火30 s，共40个循环，溶解曲线条件：95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。根据反应结束后的Ct值（Ct值为反应中每个反应管内的实时荧光信号达到设定的阈值所对应的扩增循环数），通过2-ΔΔCt法计算样品中miRNA-4465的相对表达量。

1．2．4细胞迁移和侵袭实验在进行侵袭实验时，首先用50 mg／LMatrigel1∶8稀释包被Transwell小室底部膜的上室面。消化细胞后离心弃去培养液，用含有牛血清白蛋白的无血清培养基重悬，调整细胞密度至4×108个／L。下室加入600μl含有10%胎牛血清的完全培养基，24～48 h后弃去下室培养基，90%乙醇溶液室温固定30 min。晾干后使用0．1%结晶紫溶液室温染色10 min。用棉签擦去上室的细胞，检测下室的细胞数目并随机取5个视野拍照。迁移实验不需要铺Matrigel胶，其余实验步骤与侵袭实验一致。

1．2．5miRNA-4465靶标基因预测由于miRNA与其潜在靶基因的结合具有一定的规律性，可以通过生物信息学技术进行编程从而预测miRNA的潜在靶标基因。通过在线miRNA靶基因预测工具TargetScan、PicTar和miRanda 3个数据库共同预测miRNA-4465的潜在靶点。

1．2．6荧光报告载体实验从NCBI中下载人EZH2基因序列，采用Primer5．0软件设计引物，并使用PCR法扩增EZH2 3’UTR。将EZH2 3’UTR序列插入到psiCHECK2质粒中，并将miRNA-4465相应识别位点突变后插入到psiCHECK2质粒中构建突变型质粒。EZH2 3’UTR（野生型）引物序列F：5′-TATATTCTCGAGCATCTGCTACCTCCTCCCC-3′，R：5′-TATATGCGGCCGCCAAGTTCAAGTATTCTTAT-3′；Mut-EZH2 3’UTR（突变型）引物序列F：5′-CTTTTTATTGCCTTCTCAGGTCCTGCAAAGTGTTTG-3′，R：5′-CAAAACACTTTGCAGGACCTGAGAAGGCAATAAAAAG-3′。PCR反应条件为：98℃5 s，98℃10 s，50℃5 s，72℃1 min，32个循环后72℃延伸2 min。分离PCR扩增的产物并纯化。Xho I 和Not I双酶切PCR产物及psiCHECK2质粒，转化筛选阳性克隆，挑克隆后接种于4 ml含氨苄青霉素抗性的LB培养液中，37℃恒温摇床培养10 h，小抽提取质粒后测序。扩增克隆并提纯质粒。将MDAMB-231细胞传至T25培养瓶中，待其细胞生长至30%～40%密度时将细胞消化，重悬并计数，将细胞浓度调节至5×105／ml，向24孔板中每孔加入20μl细胞悬液（即1万个细胞），用Lipofectamine 2000进行组合转染。实验分组如下：野生型组：转染入阴性对照序列＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）和miRNA-4465minics＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）；突变型组：转染入阴性对照序列＋psi-CHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突变型）和miRNA-4465 minics＋psiCHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突变型）。转染24 h后收集细胞，加入100μl的细胞裂解液（Lysis Buffer），置于摇床避光孵育15 min。吸取细胞裂解混合液，10 000 r／min离心10 min，将上清液转移至新的离心管中。在荧光素酶报告基因检测仪上检测萤火虫荧光素酶的活性值。样品荧光素酶活性＝（海肾荧光素酶活性值-本底值）／（萤火虫荧光素酶活性值-本底值）。每组实验重复3次。

1．2．7Western blot法转染后待细胞长满6孔板，使用预冷的PBS清洗细胞2次。将PBS弃去，并迅速加入细胞裂解液进行裂解。收取蛋白后采用标准曲线法检测蛋白浓度，然后加入5×上样缓冲液在100℃沸水浴中煮沸10 min。等量蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳结束后使用PVDF膜进行转膜，转膜条件为300 mA恒流60～90 min。转膜后使用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1 h，一抗4℃孵育过夜。二抗室温孵育1 h。使用化学发光仪进行显影。以GAPDH作为内参蛋白。

1．3统计学处理采用SPSS 16．0及Excel软件分析数据，计量资料结果用±s表示。两组均数比较采用t检验。

2　结果

2.1MDA-MB-231细胞转染m iRNA-4465 m inics后m iRNA-4465表达的改变miRNA-4465在NC组和miRNA-4465 minics转染组的相对表达量分别为0．99±0．10、38．69±1．70。与NC组相比，miR-NA-4465 minics转染组miRNA-4465表达水平明显升高，差异有统计学意义（t＝39．275，P＝0．001）。

2.2MDA-MB-231细胞转染m iRNA-4465 m inics后迁移和侵袭能力的改变

2．2．1对细胞迁移能力的影响Transwell迁移实验结果显示NC组和miRNA-4465 minics转染组细胞计数分别为156．67±9．29、85．67±6．03，差异有统计学意义（t＝34．715，P＝0．001），见图1。Transwell迁移实验结果表明转染miRNA-4465后MDAMB-231细胞迁移能力降低。

2．2．2对细胞侵袭能力的影响结果显示NC组和miRNA-4465 minics转染组侵袭细胞计数分别为159．67±18．18、93．00±11．00，差异有统计学意义（t＝10．151，P＝0．010），见图2。Transwell侵袭实验实验结果表明转染miRNA-4465后MDA-MB-231细胞侵袭能力降低。

2.3生物信息学技术预测 EZH2为 m iRNA-4465的靶标基因通过生物信息学技术预测了EZH2可能为miRNA-4465的潜在靶基因。图3中为TargetScan软件测出EZH2 3’UTR第250～257位（即斜体字部分）为miRNA-4465结合靶点。

2.4荧光报告载体实验证实m iRNA-4465与EZH2基因的靶向关系结果显示转染入psi-CHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）＋miRNA-4465 minics后荧光素酶活性较转染阴性对照序列（NC）＋psiCHECK2-EZH2 3’UTR（野生型）降低66．0%，差异有统计学意义（P＝0．001）；而转染入psi-CHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突变型）＋miRNA-4465 minics后荧光素酶活性较阴性对照序列（NC）＋psi-CHECK2-Mut-EZH2 3’UTR（突变型）变化不大（下调3．0%，P＝0．767），见图4。荧光报告载体实验证实miRNA-4465可以与EZH2 3’UTR结合，表明EZH2是miRNA-4465的直接作用靶点。

2.5MDA-MB-231细胞转染m iRNA-4465 m inics后EZH2蛋白的表达变化与NC组相比，将miRNA-4465 minics转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后EZH2蛋白表达降低。见图5。

3　讨论

miRNA是一类长度约为19～23个核苷酸的内源性非编码RNA，可以通过其种子序列与靶基因的mRNA3’非翻译区（3’UTR）结合而抑制靶基因的转录和翻译。目前已知的促进乳腺癌转移的miRNA有miRNA-21、miRNA-22、miRNA-103、miRNA-182、miRNA-143和miRNA-520c等；而抑制乳腺癌转移的miRNA有miRNA-20a／b、miRNA-126、miRNA-205、miRNA-15b和miRNA-200家族等［5］。miRNA-26家族成员中miRNA-26a已经证实能抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移能力［6］，而具有与miRNA-26a相同种子序列的miRNA-4465是否具有此功能尚不明确。本实验将miRNA-4465 minics转染入MDA-MB-231细胞后，成功上调了miRNA-4465的表达。随后运用Transwell迁移和侵袭实验检测了转染miRNA-4465 minics后细胞迁移和侵袭能力的改变，结果显示MDA-MB-231细胞迁移和侵袭能力均显著降低。TargetScan、PicTar和miRanda三种在线预测工具预测miRNA-4465潜在的靶标基因。TargetScan预测EZH2可能是miRNA-4465的靶标基因。本实验挑选了EZH2作为下一步的研究基因是因为：①EZH2蛋白在乳腺癌等多种恶性肿瘤内高表达；②EZH2蛋白与乳腺癌的侵袭转移密切相关［7］；③此前已经有研究［6］表明在乳腺癌细胞中miRNA-26a能调控EZH2基因的表达。miRNA-4465作为miRNA-26a同家族成员，具备相同的种子序列，也可能与EZH2 mRNA 3’UTR结合使其降解。在通过生物信息学技术预测了EZH2可能是miRNA-4465的下游靶标基因后，采用荧光报告载体实验验证了miRNA-4465与EZH2基因的靶向关系。人EZH2基因是果蝇zeste基因增强子的同源基因，属于多梳蛋白复合物（PcG）基因家族成员。EZH2蛋白作为EZH2基因的转录产物，是表观遗传学中多梳阻遏蛋白PRC2的一个重要的催化亚基，它具有组蛋白甲基转移酶的活性，能将组蛋白H3上第27位赖氨酸三甲基化（H3K27me3），从而沉默下游基因。

目前关于miRNA-26家族调控EZH2基因的研究主要集中在miRNA-26a中。Zhang et al［8］通过研究证实在乳腺癌组织中miRNA-26a的表达降低，而EZH2基因表达升高。通过将外源性的miRNA-26a转染至乳腺癌MCF-7细胞后，原先高表达的EZH2表达降低。Jansen etal［9］在他莫昔芬耐药乳腺癌细胞中也发现EZH2基因在上游受到miRNA-26a的调控。本实验结果表明了miRNA-4465与EZH2的靶向作用关系，而EZH2已经证实能促进乳腺癌的侵袭转移，miRNA-4465对MDA-MB-231细胞迁移侵袭能力的影响是否是通过调控EZH2基因实现的，还需要进一步研究。

根据miRNA-4465在乳腺癌转移过程中所扮演的角色可以为未来开展乳腺癌治疗提供新思路，即通过外源性导入miRNA-4465从而抑制乳腺癌的转移。已经有研究者发现通过外源性导入miRNAs能通过增加抗瘤活性从而抑制肿瘤的侵袭转移［10］。鉴于表观遗传学在乳腺癌发生发展过程中的重要作用，靶向抑制EZH2的表达也有可能成为乳腺癌治疗的一个新策略。目前人们已经研发了一些高选择性的EZH2抑制剂，如GSK126及GSK343等［11］。miRNA-4465和EZH2均有可能作为转移性乳腺癌的治疗新靶点，为未来乳腺癌的治疗提供新的方向。

参考文献

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中图分类号R 737．9

文献标志码A

文章编号1000-1492（2015）11-1570-05

基金项目：安徽省自然科学基金（编号：11040606M180）

作者单位：安徽医科大学第一附属医院乳腺外科，合肥230022

作者简介：骆广涛，男，硕士研究生；