pH响应的聚氨基酯聚合物纳米粒的制备及其解聚性质的研究

侯春园，乔增莹，乔圣林，安红维，赵文静，李效军

（1.河北工业大学化工学院，天津 300130；2.国家纳米科学中心纳米生物效应与安全性重点实验室，北京 100190）

侯春园1，乔增莹2，乔圣林2，安红维2，赵文静1，李效军1

（1.河北工业大学化工学院，天津 300130；2.国家纳米科学中心纳米生物效应与安全性重点实验室，北京 100190）

以1,6-己二醇二丙烯酸酯（HDDA），N,N-二丁基丙二胺（DBPA），双氨基聚乙二醇（NH2-PEG-NH2，Mn =2 000 Da）为原料，通过迈克尔加成反应以不同比例合成了pH响应性的聚氨基酯化合物，用核磁表征了其结构．这类两亲性的聚合物可以自发聚集形成胶束状纳米粒，用透射电子显微镜（TEM）表征了其形貌和粒径，纳米粒度分析仪（DLS）测定其水合粒径约30～40 nm，用GPC测得聚氨基酯化合物的分子量均在20 000以上．通过芘荧光测试和尼罗红荧光测试研究了纳米粒在酸性条件下（pH 5～6）的解散行为，验证了聚氨基酯化合物的pH响应性能．

聚氨基酯；迈克尔加成；纳米粒；pH响应性；荧光测试

0 前言

近年来，多功能聚合物在药物递送方面的应用迅速发展[1-5]．聚氨基酯（PBAEs）类聚合物具有较低的细胞毒性，能够生物降解，促进药物在胞内释放以及结构多样等优点．它们由胺与双丙烯酸酯共轭加成而制备，产率较高且无副产物．Danossu等[6]在1970年首次报道了以双丙烯酸酯和二胺为原料，通过迈克尔加成反应合成线性聚氨基酯．基于一些对小型聚合物库的初步研究，Langer课题组[7]在2003年采用半自动化的高通量合成法，建立了包含2 350种聚氨基酯的大型聚合物库，并进行了筛选．

聚合物纳米粒是由包含不同亲水性链段的嵌段共聚物在水相环境中自发地组装成为核壳结构[8]．疏水链段组成内核，能减少其与水相环境的接触；而亲水链段组成外壳，能帮助稳定内核．这样经过分子结构设计，不仅能够包载亲水或疏水的小分子药物，而且能够包载蛋白质，核酸等大分子，非常适合进行药物递送[9]．近年来pH刺激响应型纳米粒在抗癌药物的递送方面受到越来越多的关注．这是由于肿瘤组织细胞外液的pH环境呈酸性（6.8左右），细胞内内涵体和溶酶体的pH为5～6，均明显低于正常组织细胞外液的pH（约7.4）[10-12]．虽然聚氨基酯纳米粒作为基因载体方面的研究已取得较大进展[13]，但其作为pH敏感型抗癌药物载体的研究仍鲜有报道[14-16]．本文以二胺分子和双丙烯酸酯分子为原料，利用迈克尔加成，设计合成了一类聚氨基酯三嵌段共聚物．这类聚合物同时具有亲疏水部分，在水相环境中能够自组装为纳米粒，聚氨基酯嵌段形成一些疏水内核可以包裹脂溶性药物分子，PEG形成亲水性外壳．另外，由于胺的氮原子在酸性环境下可被质子化，该聚合物纳米粒具有pH响应性，有利于其在肿瘤区域的酸性环境下释放药物．如路线1所示．

路线1 pH响应的聚氨基酯纳米粒的形成和解散Scheme1 The formation and dissociation of nanoparticlesofpH-responsivepoly-amino ester s

通过对所合成的聚合物及其形成的纳米粒的结构、尺寸、形貌、pH敏感性质等进行表征，能够初步评价其作为纳米药物载体的潜力，从而得到优化的聚氨基酯药物载体．

1 实验部分

1.1 主要仪器和试剂

1H NMR谱用ARX 400MHz型核磁仪（德国Bruker公司）测定，以d6-DMSO为溶剂，TMS为内标；聚合物粒子的形貌采用透射电子显微镜（TecnaiG220S-TWIN美国FEI公司）于200 kV下观察．聚合物粒子的粒径和分布用ZatasizerNano ZS型纳米粒度及Zeta电位分析仪（英国马尔文仪器有限公司）在25℃下测量．芘荧光测试和尼罗红荧光测试用F-280型荧光光谱仪测定．

1,6 -己二醇二丙烯酸酯（HDDA，Sigma Chem ical Co，USA）；N,N-二丁基丙二胺（DBPA，Sigma Chemical Co，USA）；氨基聚乙二醇氨基（NH2-PEG-NH2，Mn=2 000 Da，上海西宝生物科技有限公司）；芘（pyrene，Sigma Chem ical Co，USA）；尼罗红（NR，Sigma Chem ical Co，USA）；十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O，优级纯，广东光华科技股份有限公司）；磷酸二氢钾(KH2PO4，优级纯，天津市津科精细化工研究所）；盐酸（HCl，分析纯，含量36%～38%，北京化工厂）；乙酸（CH3COOH，分析纯，北京化工厂）；透析袋（2 000/3 500DaMWCO，MYM Technologies Ltd，USA）．

1.2 实验方法

1.2.1 聚氨基酯的合成

称取HDDA（0.497 g，2.2mmol）和DBPA（0.372g，2mmol）于10m L圆底烧瓶，并溶于2m LDMSO中．通15 min N2以置换出反应瓶中的空气，然后在避光、50℃恒温油浴、磁力搅拌下反应5 d．待此反应结束后，向反应瓶中加入过量的NH2-PEG-NH2，继续在避光、50℃恒温油浴、磁力搅拌条件下反应5 d．反应完成后，转移入透析袋（3 500 Da MWCO）中，在去离子水中透析24 h，以除去溶剂DMSO、未反应的单体及过量的NH2-PEG-NH2．将透析后的样品冷冻干燥得浅黄色的疏松粉状产物．其合成路线如路线2所示．

路线2聚合物HDDA-DBPA-PEG的合成路线Scheme2 The synthesis routeof the polymerHDDA-DBPA-PEG

另外还以不同的投料物质的量之比合成了P1和P3聚合物．P1，P3反应物的投料物质的量比见表1．

表1 HDDA-DBPA-PEG反应物投料物质的量比Tab.1 Themolar ratiosof the reagentsof HDDA-DBPA-PEG

1.2.2 聚氨基酯纳米粒的制备

取聚氨基酯样品6mg，溶于1m LDMSO．在磁力搅拌下（900 r/m in）用注射泵向溶液中缓慢滴加2m L浓度为10mmol/L，pH为7.4的磷酸缓冲液（PB）．滴加速度设定为100L/m in，20m in加完．继续搅拌1 h，再转移入透析袋（2000DaMWCO）中，在pH7.4（10mmol/L）的PB中透析5 h，其间每2h换1次透析液，以除去溶剂DMSO．透析后的样品溶液稀释到6m L，得浓度为1mg/m L的聚合物纳米粒溶液．

1.2.3 透射电镜分析（TEM）

首先将制得的纳米粒溶液滴加至含碳支持膜的铜网，40 s后用滤纸吸去多余的样品，用醋酸双氧铀（2.0%）进行染色，作用40 s左右，用滤纸吸去多余的染色剂，自然晾干．制样结束后用透射电子显微镜进行显微结构的观察．

1.2.4 芘荧光测试

配制浓度为50mmol/L的不同pH梯度的磷酸缓冲溶液（phosphatebuffer，PB）：pH 9.0，pH 7.4，pH 7.0，pH 6.5，pH 5.9，pH 5.3，pH 5.0．

取聚氨基酯样品14mg溶于7m L纯水中，搅拌过夜．再与各含芘的不同pH的PB 1∶1等体积混合，搅拌4h．将搅拌好的溶液加入样品池，用荧光分光光度计进行芘的荧光激发光谱测试．设定发射波长为390nm，激发谱范围为300～380 nm．激发和发射狭缝宽度为5 nm．

1.2.5 尼罗红（NR）荧光测试

2 结果与讨论

2.1 聚合物的核磁表征

图1为HDDA-DBPA的核磁图，图2为HDDA-DBPA-PEG的核磁图，可以看出5.8～6.3 ppm处双键几乎消失，3.6 ppm处出现PEG峰，由此可证明HDDA-DBPAD与NH2PEGNH2共价相连．

图1 聚合物HDDA-DBPA的核磁图Fig.11HNMR spetrum of thepolymer HDDA-DBPA in d6-DMSO

图2 聚合物HDDA-DBPA-PEG的核磁图Fig.21HNMR spetrum of the polymer HDDA-DBPA-PEG in d6-DMSO

2.2聚合物纳米粒的粒径，分子量及分布

由于聚氨基酯嵌段可以形成疏水内核，PEG形成亲水性外壳，聚合物HDDA-DBPA-PEG同时具有亲疏水部分，在水相环境中能够自组装为纳米粒．纳米粒的大小和分散性可用粒径和分散系数（PDI）来表征，由电镜可以观察其形貌．表2为P1～P3聚合物纳米粒的粒径及分布，图3为P1聚合物形成的纳米粒．由表2和图3可以看出，聚合物在缓冲溶液中能够形成分散性良好的纳米粒，粒径约在30～40 nm左右．表3为用凝胶色谱仪测定的聚合物数均分子量（Mn），重均分子量（Mw）以及多分散系数（d）数据．由表3中数据可以看出，P1～P3聚氨基酯化合物的分子量均在20000以上．

图3 聚合物纳米粒的TEM图像Fig.3 TEM imagesof thenanoparticals of the polymer

表2 HDDA-DBPA-PEG纳米粒的粒径及其分布Tab.2 The sizeand polydispersity index of the polymerHDDA-DBPA-PEG

表3 聚氨基酯化合物的分子量及其分布Tab.3 TheMolecularWeight and dispersity of thePoly-amino ester sby GPC

2.3 聚合物纳米粒的pH敏感性质

2.3.1 芘荧光测试

芘荧光测试可用于研究纳米粒的pH敏感性质．芘（Py）具有多苯环的共轭结构，有很强的疏水性（在水中的溶解度为107mol/L），对环境介质的极性变化十分敏感，因此常作为分子探针用于表征两亲性分子在水溶液中聚集状态的改变[17]．在特定激发波长（485 nm）下，芘在水性溶液中的发射光谱有5个荧光峰值，其中第1个峰与第3个峰的强度比值（I338/I333）可以作为纳米粒疏水性的衡量指标．对P1～P3这3种聚合物进行芘荧光测试，以pH为横坐标，I338/I333为纵坐标作图，得图4．

图4 芘的I338/I333的比值与聚合物pH的关系图Fig.4 I338/I333ratio ofpyrenevs pH valueof thepolymer

由图4可知，P1～P3聚合物纳米粒的芘荧光测试结果类似．当pH值低于5.5左右时，I338/I333的值未发生明显变化．这是由于P1～P3聚合物中的叔胺基被完全质子化，使得具有pH响应性的聚氨基酯化合物在水相中完全溶解，没有形成聚合物纳米粒．当pH值高于5.5左右时，叔胺基逐渐被去质子化，I338/I333的值开始上升，聚氨基酯化合物开始形成纳米粒．当pH值达到6.2以上时，I338/I333的值又趋于稳定，说明聚氨基酯化合物形成了较为稳定的纳米粒．

2.3.2 尼罗红（NR）荧光探针研究纳米粒在酸性条件下的解散

尼罗红（NR）是一种独特的中性疏水分子，荧光强度随其微环境极性的增加而迅速减弱，荧光发射峰的波长红移[18-19]；通过NR荧光强度的变化可以跟踪纳米粒解离的过程．因此，NR可以作为模型疏水分子来模拟药物可控释放过程．设定激发波长为545 nm，记录聚合物纳米粒在不同pH条件下NR的发射谱，如图5所示．由图5可以看到，在pH 7.4时，P1～P3纳米粒的荧光强度最高，因为此时包裹有NR的疏水性微区非常稳定；随着pH值的降低，NR荧光强度逐渐降低，同时最大吸收波长（max）发生红移，这是纳米粒解离使疏水微区逐渐消失的结果．同时，与pH 5.9到pH 5.0的变化相比，从pH 7.4到pH 5.9的NR荧光强度降低不多，max红移也不十分明显，说明P1～P3纳米粒在pH 7.4到pH 5.9环境中比较稳定，而在pH 5.9到pH 5.0环境中迅速解散，NR被快速释放出来．此结果与图4芘荧光测试结果相一致，这样的酸敏感特性将十分有助于包载的药物在肿瘤细胞内的溶酶体中（pH5～6）可控释放．

图5 不同pH下NR荧光探针的发射谱Fig.5 Theem ission spectraof NR fluorescentprobe atdifferentpH

3 结论

采用迈克尔加成法合成了1种聚氨基酯三嵌段共聚物，并用其制备了pH响应聚合物纳米粒，TEM和DLS测得纳米粒的粒径在30～40 nm左右，该纳米粒子分散性良好，可以在体内通过EPR（增强渗透保留）效应在肿瘤部位富集，其pH响应性将十分有助于包载的药物在肿瘤组织周围（pH 6.8）以及肿瘤细胞内（pH 5）释放．这种聚合物纳米粒作为新型的pH响应型药物载体系统具有巨大的潜在应用价值．

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[责任编辑 田丰]

Preparation,self-assembly and disassociation propertiesof pH-responsive poly-am ino ester s

HOU Chun-yuan1，QIAO Zeng-ying2，QIAO Sheng-lin2，AN Hong-wei2，ZHAOWen-jing1，LIXiao-jun1

(1.SchoolofChemicalEngineering,HebeiUniversityofTechnology,Tianjin 300130,China;2.CASKey Laboratory forBiological Effectsof Nanomaterials and Nanosafety,National Center forNanoscienceand Technology(NCNST),Beijing 100190,China)

pH-responsivepolys(-am ino ester)weresynthesized viaM ichaeladdition by using 1,6-hexanedioldiacrylate (HDDA),3-(dibutylam ino)-1-propylam ine(DBPA)and am ine-PEG-am ine(NH2-PEG-NH2,M n=2 000 Da)as reagentsw ith differentratios.The structuresofcopolymerswere confirmed by1H nuclearmagnetic resonance spectroscopy(1H NMR).Thecopolymerscould self-assembleintomicelle-likenanoparticleswhichweremeasured by transm ission electronmicroscopy(TEM)and dynamic lightscattering(DLS),and showed that themean diametersofnanoparticles werearound 30～40nm.Themolecularweightsof the poly(-amino ester)smeasured by GPCwereallabove 20000. The dissociation behaviorsof polymeric nanoparticleswere investigated by the fluorescentmeasurements of pyreneand Nile Red,w hich proved the pH-responsive properties of the polys(-am ino ester).

poly-am ino ester s;M ichaeladdition;nanoparticles;pH-responsive;fluorescencemeasurements

O631

A

1007-2373(2015)01-0033-07

10.14081/j.cnki.hgdxb.2015.01.007

2014-11-03

国家自然科学基金（21304023）

侯春园（1989-），女（汉族），硕士生．通讯作者：李效军（1967-），男（汉族），教授．

数字出版日期：2015-01-24数字出版网址：http://www.cnki.net/kcms/detail/13.1208.T.20150124.0944.003.html