MELAS综合征的临床及基因诊断研究

陈燕 曹秉振 刘磊 克丙申 苏净 房淑欣

MELAS综合征的临床及基因诊断研究

陈燕 曹秉振 刘磊 克丙申 苏净 房淑欣

MELAS综合征；线粒体DNA；聚合酶链反应

线粒体脑肌病伴高乳酸血症及卒中样发作(MELAS)是由线粒体结构或功能缺陷导致的以神经肌肉系统病变为主的多系统疾病，是一种母系遗传病[1]。1984年Pavlakis等[2]报道了首例MELAS综合征患者，该患者以脑卒中样发作和高乳酸血症为主要特点。研究发现其热点突变为mtDNAA3243G突变[3]。本研究报道5例MELAS患者的临床特点及基因检测结果。

1 对象和方法

1.1 对象 收集 2008-2011年就诊济南军区总医院临床确诊或疑诊的MELAS综合征患者5例。诊断标准：(1)临床至少有1次卒中样发作；(2)急性期在CT或MRI上可见与临床表现相关的责任病灶；(3)脑脊液和(或)运动前后血乳酸升高；(4)肌肉活检MGT染色可见破碎红纤维(RRF)。

1.2 方法 总结分析5例患者的临床表现、实验室检验、电生理检查、影像学检查及基因突变检测资料。

1.2.1 肌肉或脑组织活检检查：患者例1、2行肌肉活检检查，例2行电子显微镜检查；例3、5行脑组织活检检查；例4在外医院行肌肉活检检查。

1.2.2 基因学检查：使用TaKaRa 血液DNA提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司提供)提取患者静脉血DNA，或使用TaKaRa 肌肉组织DNA提取试剂盒(大连宝生物工程有限公司提供)提取患者肌肉组织DNA。上游引物：P1：5′-CCTCCCTGTACGAAAGGACA-3′；下游引物: P2：5′-GCCTAGGTTGAGGTTGACCA-3′，P3：5′-CCGATCAGGG-CGTAGTTTGA-3′。行PCR扩增，各反应体系均为50 μL，具体方法如下：PCR反应参数设定：94℃预变性4 min，94℃变性30 s，退火温度56℃ 30 s，72℃延伸1 min，35个循环，4℃保存。测DNA序列。

2 结果

2.1 临床特点 5例患者均为男性，发病年龄为13～39岁，5例患者首发症状分别为精神症状伴左侧肢体无力、视物不清伴四肢抽搐、头痛伴视物模糊、头痛伴左侧肢体无力及视物不清，其中3例患者有卒中样发作史，4例患者有肢体抽搐病史，4例表现为偏头痛伴视力下降，2例患者有听力损伤。

2.2 实验室检查结果 血乳酸增高4例，肌电图检查结果提示肌源性损害4例，5例患者脑电图检查均提示重度异常脑电图表现，头颅MRI检查主要为颞、枕、顶叶的不对称病灶(图1)，3例患者肌肉组织有破碎红纤维(图2)，1例行肌肉电镜检查发现异常线粒体(图3)，2例患者脑组织活检可见皮层组织呈分层样改变。

2.3 基因检测结果 3例患者存在A3243G突变(图4)，1例未发现3243位点的突变，但发现了A3136G及T3336C位点的突变，1例出现线粒体基因3314-3589之间276 bp的碱基缺失。

图1 患者3第1次发作时脑MRI T2WI检查示右侧枕叶异常信号

图2 患者1 肌肉组织可见典型破碎红纤维(箭头所示,MGT染色,×400)

图3 患者2肌肉组织电镜检查发现异常线粒体，线粒体体积大小不一，出现巨线粒体(箭头所示)，线粒体基质电子密度不一，嵴的方向和形态各异

图4 患者1肌肉组织基因测序图谱，箭头所示即为3243突变位点

3 讨论 MELAS综合征患者一般患病年龄较轻(<45岁)，缺乏常见的卒中危险因素，听力障碍和偏头痛、癫痫、精神症状多为首发症状，最终出现脑卒中样发作，急性卒中以一侧或双侧枕叶、颞叶受累最为常见，常出现非MELAS临床表现，如线粒体心肌病、母系遗传性糖尿病和/或耳聋以及无症状的基因携带者等。本研究5例患者发病年龄较轻，均小于45岁，首发症状分别为精神行为异常、偏头痛样发作、视物不清、肢体抽搐，5例患者中有3例出现卒中样发作，4例患者出现偏盲，患者2、4出现听力下降，患者1、2、4、5最后均有癫痫样发作，为强直阵挛样发作，此类癫痫样发作发作间期脑电图正常，常被误诊为症状性癫痫。

高乳酸血症是MELAS综合征的特征性表现，高乳酸血症对此病的早期诊断具有重要的临床价值。5例患者中有4例化验血乳酸增高。MRI检查可见颞叶、顶叶、枕叶的广泛长T1和长T2信号，以皮层下白质受累为主。病灶不符合单血管分布，血管检查无脑动脉粥样硬化、狭窄的证据，病灶区域脑血流不是减少而是增加[4]。且具有病灶的移行性和易复发性。5例患者均出现枕叶、颞叶或顶叶损害，病灶不对称。骨骼肌活检冷冻切片，MGT染色可见有大量异常线粒体聚集的破碎红纤维，电镜下可见大量异常线粒体，部分病例可见类结晶样的包涵体[5]。对此病诊断具有重要的意义。

MELAS综合征患者的线粒体突变位点中最常见的是A3243G的突变，约占全部突变的80%，其次是T3271C，约占10%[6]。有研究发现突变通过连续的世代遗传，使突变的mtDNA逐渐增加，可出现遗传早现现象[7]。本研究发现患者1存在A3243G突变，且突变型明显大于野生型，患者2、4亦发现了典型的A3243G突变，均为突变型与野生型混合，且野生型大于突变型。患者3没有发现3243位点的突变，但发现了T3336C的突变和A3136G的突变，其中3336位点全部为突变型，经检索PubMed此突变为同义突变，无临床意义，未检测到3136位点的突变与MELAS综合征有关。该例患者基因测序未检测到3243位点的突变，其原因可能与其突变水平低，未达到此方法可以检测到的水平有关，需要用更敏感的试验方法来进一步检测；也可能患者无3243位点突变，需要做进一步的研究。患者5经PCR检测发现了1条约为200 bp的异常基因条带，通过多次行PCR并电泳检测排除伪差后，仍有约为200 bp的异常基因条带，经测序未发现3243位点的基因突变，而出现了3314-3589之间276 bp的碱基缺失，考虑mtDNA 3314-3589属于MTND1基因，该基因的表达产物是还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶(NADH)，后者是构成线粒体呼吸链复合体Ⅰ的7个亚基之一。因此推测，mtDNA 3314-3589之间大片段的碱基缺失，可能导致MTND1基因的表达异常，影响NADH的活性，从而影响线粒体ATP的生成减少，最终导致脑组织、肌肉组织等的功能甚至结构异常。

综上所述，对于出现卒中样发作、抽搐、运动不耐受等症状，脑MRI多发性且与血管分布区不一致性的影像信号的年轻患者时，应高度怀疑本病的可能，并行乳酸丙酮酸运动耐量试验、肌活检检查以明确诊断，可留取患者静脉血，用PCR产物直接行线粒体基因测序确诊，直接测序可避免PCR本身造成的基因突变。但由于MELAS综合征患者的基因突变位点多，只针对特定位点的测序有一定的局限性。

[1]Wang Z, Xiao J, Xie S, et al. MR evaluation of cerebral oxygen metabolism and blood flow in stroke-like episodes of MELAS[J].J Neurol Sci, 2012,323(1-2):173-177.

[2]Pavlakis SG, Phillips PC, DiMauro S, et al.Mitochondria myopathy, encephalomyopathy,lactic acidosis, and stroke-like episodes:a distinctive clinical syndrome[J].Ann Neurol,1984,16(4):481-488．

[3]Goto Y, Nonaka I, Horai S. A mutation in the tRNA (Leu) (UUR) gene associated with the MELAS subgroup of mitochondrial encephalomyopathies[J]. Nature,1990,348(6302): 651-653．

[4]黄文才，汤群峰，李国雄，等.线粒体脑肌病卒中样病灶的磁共振诊断及波谱分析[J].实用放射性杂志,2010,26(4)：457.

[5]贾建平,崔丽英,王伟,等. 神经病学[M].第6版. 北京:人民卫生出版社,2008.378-382.

[6]Choi BO, Hwang JH, Cho EM, et al. Mutational analysis of whole mitochondrial DNA in patients with MELAS and MERRF diseases[J]. EXP Mol Med,2010,42(6):446-455.

[7]DiMauro S, Schon EA. Mitochondrial respiratory chain diseases[J]. N Eng ZJ Med, 2003,348(26):2656-2668.

(本文编辑：邹晨双)

10.3969/j.issn.1006-2963.2015.04.021

250031山东省交通医院神经内科(陈燕、刘磊、房淑欣)；250031济南军区总医院神经内科 (曹秉振、克丙申、苏净)

陈燕，Email：law1984 @126.com

R596.1;R742.8+9

D

1006-2963 (2015)04-0379-02

2014-11-21)