高效液相色谱法分析青荚叶中豆甾醇的含量

梁春辉，张寒，李雪宁

(1.西安市儿童医院，陕西 西安 710003;2.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021;3.兴平408 医院，陕西 咸阳 713100)

青荚叶［Helwingia japonica(Thunb)］为山茱萸科(Cornaceae)青荚叶属(Helwingia Willd)植物，又名叶上花、叶上果，全株入药。其根味辛，微甘，性平，能驱风除湿，祛瘀活血。可治胃痛、痢疾、便血、子宫脱出等病症。其叶入药，可治小儿高烧，外用治烧烫伤、毒咬伤，也有清热解毒、消肿止痛的功效。其干燥茎髓入药，药名小通草，具有清热利尿、下乳等作用［1］。

青荚叶的化学成分有β-谷甾醇、棕榈酸甘油酯、桂 皮 酸、6α-H-4-烯-3-酮-豆 甾 醇、6α-H-4-烯-3-酮-豆甾醇［2］等。药理实验表明，β-谷甾醇、豆甾醇具有明显的降胆固醇、止咳、抗癌、抗炎等药理作用［3］。分析方法有薄层扫描法、气相色谱法、高效液相色谱-紫外检测法、高效液相色谱-ELSD 法等［4-5］。

本文采用RP-HPLC 测定青荚叶中豆甾醇含量，豆甾醇与相邻组分分离度良好，方法的重复性、稳定性、精密度、加样回收率均符合有关规定，可用于该药材的质量控制。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

豆甾醇对照品(上海金穗生物科技有限公司，批号:JS90510);甲醇，色谱纯;水为娃哈哈纯净水;氯仿等均为分析纯;青荚叶，两批采自秦岭太白山，两批购自西安万寿路药材批发市场，经西安医学院生药教研室张寒老师鉴定为山茱萸科青荚叶。

Agilent1260 高效液相色谱仪，Thermo C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，紫外检测器;KQ-300B超声波清洗器;GR-202 分析天平。

1.2 溶液配制

1.2.1 豆甾醇对照品溶液的配制 精密称定豆甾醇对照品13.5 mg，置25 mL 容量瓶中，用甲醇∶氯仿(1∶1)溶解并定容，制成0.54 mg/mL 的豆甾醇对照品溶液。

1.2.2 豆甾醇供试品溶液的配制 精密称取青荚叶药材3 份，置500 mL 圆底烧瓶中，加入100 mL 甲醇∶氯仿(1 ∶1)，浸泡1 h，65 ℃水浴回流提取1 h，倒出提取液，再加100 mL 甲醇∶氯仿(1 ∶1)，65 ℃水浴回流提取1 h。倒出提取液，合并两次提取液，放冷，抽滤，旋转蒸发仪蒸干。加甲醇∶氯仿(1 ∶1)溶解，移至25 mL 容量瓶中，用甲醇∶氯仿(1 ∶1)定容，得供试品溶液。

1.3 色谱条件

色谱柱为Thermo C18柱(250 mm ×4. 6 mm，5 μm)，流 动 相 为 甲 醇∶ 水(97 ∶ 3)，流 速1.0 mL /min，进样量20 μL，检测波长210 nm［6］，理论塔板数为2 000 以上，豆甾醇峰的分离度符合要求。

2 结果与讨论

2.1 青荚叶中豆甾醇含量测定

分别取对照品溶液和供试品溶液5 mL，用0.45 μm有机微孔滤膜过滤至微量离心管中，精密吸取20 μL，注入高效液相色谱仪，进行测定。结果见图1、图2。由图1、图2 可知，供试品中豆甾醇与对照品色谱峰保留时间一致，达到基线分离。

图1 豆甾醇对照品液相色谱图Fig.1 Stigmasterol control liquid chromatogram

图2 青荚叶供试品液相色谱图Fig.2 Helwingia sample liquid chromatogram

2.2 线性关系考察

精 密 量 取 对 照 品 溶 液0. 1，0. 2，0. 4，0. 8，1.0 mL至5 mL 容量瓶中，用甲醇∶氯仿(1∶1)定容，摇匀。分别进样20 μL 测定。以对照品进样浓度为横坐标(X)，峰面积积分值为纵坐标(Y)，分别绘制标准曲线，得豆甾醇回归方程y =6 252.2x－1.176 7，R2=0.999 5(n =5)。结果表明，豆甾醇进样量在0.216 ～2.16 μg 范围内，线性关系良好。

2.3 重复性

精密量取豆甾醇对照品溶液6 份，各20 μL，分别进样，测定峰面积，每份样品重复3 次，结果豆甾醇含量平均峰面积为3 321.37，RSD=1.43%。

2.4 加样回收率

精密称取青荚叶样品3 份，精密量取1 mL 对照品溶液，分别加入到3 份样品中，进行提取制样，进行测定，计算加样回收率。结果平均加样回收率为97.79%，RSD 为3.107%。

2.5 样品含量测定

取供试品溶液，用0.45 μL 微孔滤膜过滤后进样测定，结果见表1。

表1 样品测定结果Table 1 Samples for the determination of results

2.6 稳定性

精密量取豆甾醇对照品溶液，分别在0，2，4，8，12，24 h 各进样20 μL，分别测定它们的峰面积，测得豆甾醇含量的RSD =0.97%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.7 流动相选择

本实验曾采用甲醇-水比例90 ∶10，96 ∶4，97 ∶3为流动相，流速1. 0 mL/min，结果表明以甲醇-水(97 ∶3)为流动相时豆甾醇的峰形及出峰时间(24 min)最佳。此条件下，方法的可靠性、准确性和重复性好，适用于青荚叶药材中豆甾醇的含量测定。

3 结论

采用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)测定青荚叶中豆甾醇的含量，色谱柱为Thermo C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇∶水(97∶3)，流速1.0 mL /min，进样量20 μL，检测波长210 nm。结果表明，豆甾醇进样量在0. 216 ～2.16 μg 范围内，其峰面积与浓度呈良好的线性关系(R2=0.999 5)，回收率为97.79%。该法灵敏、简单易行，专属性、重复性、回收率均符合要求。可作为青荚叶中豆甾醇的含量测定方法。

［1］ 李双妹.青荚叶多糖的提取及含量测定［J］.温州职业技术学院学报，2010，10(2):49-52.

［2］ Xia Lizi，Zhou Min，Xiao Yanhua，et al.Chemical constituents from Helwingiajaponica［J］.Chinese Journal of Natural Medicines，2010，8(1):16-20.

［3］ 李英霞，谷颜杰，马承严. HPLC 同时测定大豆甾醇提取物中β-谷甾醇和豆甾醇的含量［J］.中成药，2008，30(5):751-752.

［4］ 王淑美，吴明侠，许闽，等.地黄中β-谷甾醇的含量测定［J］.黑龙江医药，2001，14(4):255-256.

［5］ 张海波，李钦. HPLC-ELSD 法测定不同时期玉米须中β-谷甾醇的含量［J］. 河南大学学报，2006，25(4):53-55.

［6］ 魏志奇，陈幸，李彬，等.高效液相色谱法测定川木通中豆甾醇的含量［J］. 时珍国医国药，2009，20(3):574-575.