青蒿素对大鼠心梗后交感神经重构的影响及其机制研究

郑武扬,李卫华,谢强,黄峥嵘,万晓群

(厦门大学附属第一医院 心血管内科，福建 厦门 361000)



青蒿素对大鼠心梗后交感神经重构的影响及其机制研究

郑武扬,李卫华,谢强,黄峥嵘,万晓群

(厦门大学附属第一医院 心血管内科，福建 厦门 361000)

目的 研究青蒿素对大鼠心梗后交感神经重构的作用并探索其分子机制。方法 SD雄性大鼠70 只，随机分成3组，假手术组10只，心梗组30只，心梗治疗组30只。开胸结扎冠状动脉左前降支制造心梗动物模型，术后24 h开始灌胃大鼠，心梗治疗组给予青蒿素 75 mg/(kg·d)，每天分3次灌胃，心梗组给予等剂量的 0.5%羧甲基纤维素钠。假手术组开胸仅冠状动脉下穿线但不结扎，同时给予等剂量的0.5%羧甲基纤维素钠。治疗4周后，将动物处死并按需要取材。Masson染色法测量左室梗死面积，免疫组织化学定量分析梗死周边区生长相关蛋白(growth associated protein 43，GAP43)与酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)阳性交感神经纤维的分布和密度及巨噬细胞数目，蛋白免疫印迹法检测梗死周边区IKBα、GAP43、TH、NGF等的表达。RT-PCR检测心肌组织炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平。结果 心梗组与心梗治疗组心梗面积没有显著差异。心梗组GAP43和TH阳性交感神经纤维密度高于假手术组(P<0.05)，心梗治疗组GAP43和TH阳性交感神经纤维密度低于心梗组(P<0.05)。心梗组TNF-α和IL-1β的mRNA高于假手术组(P<0.05)，心梗治疗组炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA低于心梗组(P<0.05)。心梗组IKBα蛋白高于假手术组(P<0.05)，心梗治疗组IKBα蛋白表达低于心梗组(P<0.05)。心梗组NGF、GAP43及TH蛋白的表达高于假手术组(P<0.05)，心梗治疗组NGF、GAP43及TH蛋白的表达水平低于心梗组(P<0.05)。梗死组巨噬细胞数目比假手术组高，而心梗治疗组巨噬细胞数目低于心梗组(P<0.05)。结论 青蒿素可以抑制心梗后交感神经重构，其机制可能是通过抑制心梗后炎症反应。

青蒿素；交感神经重构；心肌梗死

恶性室性心律失常(室性心动过速，室速；心室颤动，室颤)是心梗后患者死亡的主要原因，约占心梗后患者死亡的一半以上[1]。心梗后交感神经的过度再生，在心梗后的室性心律失常的发生中起着重要的作用，为心梗后恶性心律失常的发生提供了电学基质[2]。因此，有效地抑制心梗后交感神经过度再生，可能是预防和治疗心梗后心律失常的有效途径之一。

目前，有关心梗后交感神经重构的机制还不是很清楚。但是，有证据表明，炎症反应在心梗后交感神经重构的过程中起着重要作用[3-4]。研究显示炎症细胞合成神经生长因子(nerve growth factor，NGF)，而且炎症细胞聚集的区域，交感神经再生明显，其密度显著高于其它区域[5-6]。此外，有学者相继报道，心梗后给予抗炎治疗可以显著减缓交感神经重构[7]。这些研究结果均表明，抑制炎症反应可能是减缓心梗后交感神经重构的有效途径之一。

青蒿素是一种从菊科植物黄花蒿中提取的具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，是世界卫生组织公认的抗疟疾药物[8]。现代医学研究发现，青蒿素除了抗疟疾之外，还存在其它生物学作用，如免疫调节、抗炎症、抗纤维化等[9]。鉴于青蒿素具有抑制 NF-κB 活性抗炎症等生物学作用，猜测其可能具有抗心梗后交感神经重构的生物学作用。本文通过研究青蒿素对大鼠心梗后交感神经重构的作用并探索其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：SPF 级健康成年雄性 SD 大鼠(购自华中科技大学同济医学院动物实验中心)合格证号601036，体质量为250～300 g。本实验遵循《实验动物保护条例》。

1.1.2 实验器材：小型动物呼吸机，江西省特立麻醉呼吸设备有限公司LEAD-2000B 32；导电生理记录仪，四川锦江电子设备有限公司；MILLI-Q超纯水纯化系统，美国 Millipore有限公司；电泳转膜装置，美国 Bio-Rad有限公司；荧光倒置显微镜，德国Leica有限公司；VL凝胶成像分析系统，法国；蛋白印迹杂交系统，美国 Bio-Rad有限公司；Olympas BX60 光学显微镜，日本 Olympas有限公司；冰冻超高速离心机，德国 Heraeus 有限公司。

1.1.3 主要试剂：戊巴比妥钠冻干粉，美国 Sigma 公司RNA抽提试剂盒(Trizol)，北京万辉双鹤药业有限责任公司；青蒿素(H10970338)，广西制药厂羧甲基纤维素钠(GB2760-2011)，山东江北化工有限公司；RT-PCR试剂盒，美国 Biosystem公司；GAP43兔抗大鼠多克隆抗体，美国 Invitrogen公司；TH兔抗大鼠多克隆抗体，美国Sigma公司；NGF兔抗大鼠多克隆抗体，美国Sigma公司；小鼠抗白介素1β抗体，Abcam小鼠抗肿瘤坏死因子α，Abcam抗β-actin抗体。IL-1β的引物序列：F：5‘-GGGATGATGACGACCTGC-3’，R：5’-CCACTTGTTGGCTTATGTT-3’；TNF-α的引物序列：F：5’-GCCACCACGCTCTTCTGTC-3’，R：5’GCTACGGGCTTGTCACTCG-3’；GAPDH的引物序列：F：5’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’，R：5’-CATTTGATGTTAGCG-GGAT-3’。

1.2 方法

1.2.1 分组造模：70只大鼠随机分成3组，假手术组10只，心梗组30只，心梗治疗组30只。

大鼠心梗模型的造模步骤：大鼠按照30 mg/kg的剂量腹腔注射10%戊巴比妥钠；麻醉成功后将其四肢用橡皮筋固定于自制的手术台上，用小剪刀减去颈部和胸部的毛，四肢连接多道电生理记录仪电极，行心电监护；钝性分离颈部肌肉，暴露气管，将自制的气管插管针插入气管；将气管插管与小型动物呼吸机相连接，调节潮气量12 mL，呼吸比2:1，频率70次/分；手术刀片沿左侧胸骨切开皮肤，伤口长约2.5 cm，钝性分离胸大肌，直至暴露肋骨，用2把止血钳将第4～5根肋骨咬断，注意防止肋间动脉出血，用开睑器将其撑开；用小剪刀剪开心包膜，充分暴露心脏；用棉签从左心耳处将心脏挑起，从肺动脉圆锥和左心耳之间，距离左心耳根部约2 cm处，结扎冠状动脉前降支，进针深度约0.5 mm，以6/0缝线穿过肌层，针尖穿出后小心抽出针，结扎缝线，观察心电图的变化，结扎线以下区域可见颜色变白，心肌收缩减慢，同时Ⅰ导联aVL导联ST段向上抬高，大于0.2 mV，并且可见频发的室性心律失常，以上提示结扎成功。留置排气导管置入心脏胸腔，逐层缝合肌肉和皮肤，用注射器抽吸胸腔内的积血和空气，最后拔除导管。术后腹腔注射青霉素40万单位，肌注1周；假手术组，开胸暴露心脏的方法同前，冠脉前降支下穿过结扎线，不缝合。

给药途径和时间：大鼠心梗后24 h，青蒿素溶解在 0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，心梗治疗组按75 mg/(kg·d)的剂量分3次灌胃大鼠，每次间隔1天。心梗组和假手术组给予等量的 0.5%羧甲基纤维素钠溶液，持续时间为 4周，后将动物处死并按需要取材。

心梗面积计算：Masson染色后，心肌梗死区全部是胶原纤维，呈蓝色，心肌细胞被染成红色。病理专业图像分析软件 Image-Pro Plus 6.0，计算左室梗死面积(梗死面积=梗死区心内膜长度/整个左心室心内膜长度)。

1.2.2 蛋白免疫印迹分析IKBα蛋白的表达：将150 mg左右的心肌组织放入匀浆器，同时加入组织裂解液1 mL，组织匀浆器彻底匀浆，4 ℃条件下，12000 r/min的速度离心 15 min，将其上清液保存在-70 ℃条件下备用；加5 μL样品到96孔板样品孔，加标准品稀释液到20 μL；各孔中加入200 μL G250染色液，混匀后，室温下放置5 min；运用酶标仪测定各孔A595时的吸光值，并且该值作为Y轴，而蛋白浓度作为X轴，绘制曲线，根据曲线计算样品中蛋白浓度；SDS-PAGE 电泳，200 mA横流转膜，30～40 min；将NC膜放入TBST稀释的一抗中，在4 ℃条件下孵育过夜；TBST洗膜，每次10 min，共3次；将NC膜放入TBST稀释的二抗中，在4 ℃条件下孵育过夜；TBST洗膜，每次10 min，共3次；将ECL显影液(等量混合)，孵育5 min(室温下)，准备好保鲜膜和胶片(暗房里操作)，准备曝光，曝光结束后取下胶片，显影定影各5 min，最后用自来水冲洗。蛋白免疫印迹定量分析：凝胶成像分析系统对胶片进行扫描，Bandscan软件对图像条带作半定量分析，以内参β-actin的条带吸光值作为参考标准。目的条带和β-actin的条带吸光值的比值作为钙蛋白表达相对量。

1.2.3 免疫组织化学分析TH和GAP43染色的阳性神经纤维密度：心肌组织标本经多聚甲醛浸泡后，石蜡包埋处理，5 μm厚度切成片；对组织进行脱蜡，切好的组织切片进行水化；3%的双氧水，室温下灭活5～10 min，蒸馏水冲洗3次；用正常血清工作液封闭，将内源性过氧化物酶活性灭活，室温条件下孵育10 min；将血清甩去，滴加GAP43指标的兔抗大鼠抗体 GAP43，0.05 mL，37 ℃条件下孵育2 h；PBS洗涮3次，每次约3～5 min；滴加稀释10倍二抗生物素标记羊抗兔IgG10%，0.05 mL，37 ℃条件下孵育10～15 min；PBS洗3次，每次约3～5 min；滴加辣根酶链霉素工作液，37 ℃条件下孵育10～15 min；PBS洗3次，每次约3～5 min；DAB显色；自来水冲洗；苏木素染色；梯度酒精脱水；二甲苯透明处理；最后用中性塑胶来封片；最后，对TH和GAP43染色的阳性神经纤维进行密度分析，其具体方法参照文献[6]。

1.2.4 NGF蛋白表达检测：使用免疫组化SABC方法检测、心肌组织炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平用RT-PCR检测，取心肌组织100mg剪碎，用Trizol法提取总RNA。按照试剂说明进行RT-PCR反应。以GAPDH为内参照，采用2-CT方法分析目标基因的相对表达量。免疫组织化学检测梗死周边区巨噬细胞数目。

2 结果

2.1 心梗模型与心梗面积 心梗后 4 周，假手术组死亡1只，存活率为90%；心梗组死亡18只，存活率为40%；心梗治疗组死亡10只，存活率67%。经 Masson染色和病理分析，心梗组和心梗治疗组心梗面积分别为(34.50±2.36)%、(33.77±4.05)%，心梗组和心梗治疗组之间的心梗面积没有统计学差异。

2.2 交感神经纤维的分布和密度 本研究观察青蒿素对大鼠心梗后GAP43和TH阳性交感神经纤维的分布及密度。研究发现心梗后梗死周边区，GAP43和TH阳性交感神经纤维分布紊乱，直径粗乱，纤维密度高，见图1。心梗组与假手术组相比，GAP43和TH阳性交感神经纤维密度显著增加(P<0.05)。心梗治疗组GAP43和TH阳性交感神经纤维密度比心梗组显著降低(P<0.05)，见表1。

图1 青蒿素对梗死周边区GAP43和TH染色阳性的交感神经纤维的影响Fig.1 Effect of artemisinin on density of GAP43 and TH-positive sympathetic nerve fiber in peripheral areas of infarction

组别只数治疗后(μm2/mm2)GAP43TH假手术组9599.66±68.41*539.66±62.72*心梗组123103.5±238.693113.25±402.61心梗治疗组202024.23±286.71*1995.46±243.48*

*P<0.05，与心梗组相比，compared with MI group

2.3 RT-PCR检测心肌组织炎症因子TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平 青蒿素具有抗炎症的作用，本研究通过RT-PCR检测梗死周边区心肌组织炎症因子TNF-α 和 IL-1β 的 mRNA 表达水平。研究表明，与假手术组相比，心梗组梗死周边区 TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平显著增加(P<0.05)，与心梗组相比，心梗治疗组炎症因子 TNF-α和IL-1β的 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)，见表2。

表2 心肌组织炎症因子 TNF-α和 IL-1β 的 mRNA表达水平

*P<0.05，与心梗组相比，compared with MI group

2.4 蛋白免疫印迹检测IKBα蛋白的表达 心梗后4周，本研究通过蛋白免疫印迹的方法检测梗死周边区IKBα蛋白的表达，结果发现心梗组IKBα蛋白比假手术组要高(P<0.05)，青蒿素治疗可以显著减小IKBα 蛋白表达(P<0.05)，见表3。

表3 蛋白免疫印迹检测IKBα蛋白的表达±s)

*P<0.05，与心梗组相比，compared with MI group

2.5 蛋白免疫印迹检测NGF、GAP43、TH 蛋白的表达 心梗后4周，心梗组梗死周边区NGF蛋白的表达显著高于假手术组，青蒿素治疗可以显著减少NGF 蛋白的表达水平。心梗组梗死周边区的心肌组织中GAP43和TH蛋白表达含量显著高于假手术组，而青蒿素治疗后表达显著减少(P<0.05)，见图2、表4。

图2 蛋白免疫印迹法分析青蒿素对心梗后梗死周边区 NGF、GAP43和TH蛋白表达水平的影响Fig.2 Analysis of the effect of artemisinin on expression of NGF, GAP43 and TH protein by Western blot after MI

组别只数NGFGAP43TH假手术组90.61±0.11*0.58±0.17*0.57±0.15*心梗组121.96±0.212.01±0.131.99±0.14心梗治疗组201.24±0.13*1.28±0.09*1.23±0.07*

*P<0.05，与心梗组相比，compared with MI group

2.6 免疫组织化学检测梗死周边区巨噬细胞数目 巨噬细胞在心梗后交感神经重构中起重要作用，本研究发现心梗后4周，梗死周边区巨噬细胞数目比假手术组高，而青蒿素治疗可以有效降低梗死周边区巨噬细胞数目(P<0.05)，见图3、表5。

图3 大鼠梗死周边区巨噬细胞数目Fig.3 Macrophages mumber in infarcted border zone after MI in rat

组别只数巨噬细胞数目假手术组9 16.00±9.00*心梗组121537.00±128.00心梗治疗组20396.00±49.00*

*P<0.05，与心梗组相比，compared with MI group

3 讨论

青蒿素是一种从菊科植物黄花蒿中提取的具有过氧桥的倍半萜内酯类化合物，是世界卫生组织公认的抗疟疾药物[10]。现代医学研究发现，青蒿素除了抗疟疾之外，还存在其它生物学作用，如免疫调节、抗炎症、抗纤维化等[11-12]。本研究发现青蒿素抑制大鼠心梗后交感神经再生，同时缓减心梗后梗死周边区炎症反应，减少神经生长因子以及炎症介质的表达。本研究发现青蒿素治疗可以显著减少心梗后梗死周边区炎症因子的表达和炎症细胞的数目，同时还发现青蒿素治疗可以抑制核因子 KB 的激活，主要通过抑制 IKB蛋白的磷酸化。炎症细胞在心梗后NGF的合成中起着重要的作用[13-15]。Hasan 等研究发现梗死周边区 NGF 表达显著高于非梗死区，而且梗死周边巨噬细胞和肌纤维母细胞数目很高，这些结果提示炎症细胞可能是 NGF 的重要来源[3]。而本研究发现心梗后4周，青蒿素治疗组梗死周边区心肌组织的NGF浓度和巨噬细胞数目都显著低于对照组。这些结果表明，青蒿素降低心肌组织中的 NGF浓度可能是通过减少心肌组织中巨噬细胞数目实现的。青蒿素治疗可以显著缓减梗死周边区交感神经再生降低梗死周边区心肌组织中NGF的浓度，这些结果提示抑制心梗后心肌组织中NGF的表达可能是青蒿素减缓心梗后交感神经重构的主要机制。

综上所述，本研究首次报道青蒿素可以抑制心梗后交感神经重构，而且其机制可能是通过抑制心梗后炎症反应，该研究为临床运用青蒿素治疗心梗后交感神经过度再生提供了理论依据。鉴于交感神经重构与心律失常的发生密切相关，因此我们推测青蒿素可能为临床治疗心梗后恶性室性心律失常提供了新的选择。

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(编校：王俨俨,吴茜)

Effect of artemisinin on remodeling of sympathetic nerve and its mechanism of myocardial infarction rats

ZHENG Wu-yang,LI Wei-hua,XIE Qiang,HUANG Zheng-rong,WAN Xiao-qun

(Department of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen 361000, China)

ObjectiveTo study the effect of artemisinin on remodeling of sympathetic neural in rats with myocardial infarction and explore its molecular mechanism.Methods70 SD male rats were randomly divided into three groups, 10 rats in sham operation group, 30 rats in myocardial infarction group, 30 rats in MI administration group.The myocardial infarction model was induced by ligating the left anterior descending coronary artery.After 24 h, the rats in myocardial infarction administration group were gavage with artemisinin of 75 mg/(kg·d), three times a day, meanwhile, MI group received isodose 0.5% of sodium carboxymethyl cellulose.Sham operation group were only opened chestcoronary artery under wear line but not ligation, while given isodose 0.5% of sodium carboxymethyl cellulose.Four weeks after treatment, the rats were sacrificed and drawed materials according to the needs.Infarcted size of left ventricular were measured by Masson staining method.The growth associated protein in infarcted border zone (GAP43), distribution and density of tyrosine hydroxylase (TH)-positive nerves, number of macrophages were quantitatively analysed by immunohistochemical method.IKB alpha, GAP43, TH and NGF in infarcted border zone were detected by Western blot.The inflammatory factor of TNF-α and IL-1 β mRNA expression level were detected by RT-PCR.ResultsThere was no difference in myocardial infarction area between MI group and MI administration group.GAP43 and TH positive sympathetic nerve fibers density in MI group were higher than those in sham operation group, and the above indexes in MI administration group were lower than those in MI group (P<0.05).TNF-α and IL-1 β mRNA expression levels in MI group were higher than those in sham operation group, and the above indexes in MI administration group were lower than those in MI group(P<0.05).IKB α protein in MI group was higher than that in sham operation group, and the above indexes in MI administration group were lower than those in MI group(P<0.05).Protein expressions of NGF, GAP43 and TH were higher than those in sham operation group, and the above indexes in MI administration group were lower than those in MI group(P<0.05).The number of macrophages was higher than that in sham operation group, and the above index in MI administration group were lower than that in MI group(P<0.05). ConclusionArtemisinin could inhibit the remodeling of sympathetic nerve after myocardial infarction, and its mechanism may be to inhibit the inflammation after acute myocardial infarction.

artemisinin; sympathetic nerve remodeling; myocardial infarction

郑武扬，男，硕士，副主任医师，研究方向：心脏电生理，E-mail：zwy18959213920@163.com。

R541.7

A

1005-1678(2015)01-0081-04