UPLC测定丹七片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量

孙英英,郭玉海,林华庆,余楚钦,张伦,罗程佳

(1.广东药学院 药物研究所，广东 广州 510006；2.广东省中医院 骨一科，广东 广州 510006)



UPLC测定丹七片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的含量

孙英英1,郭玉海2,林华庆1,余楚钦1,张伦1,罗程佳1

(1.广东药学院 药物研究所，广东 广州 510006；2.广东省中医院 骨一科，广东 广州 510006)

目的 建立超高效液相色谱法(ultra performance liquid chromatography,UPLC)分离测定丹七片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1含量。方法 采用ACQUITY UPLC HSS T3(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)色谱柱，柱温30 ℃，以乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱，流速0.3 mL/min，检测波长203 nm，进样体积2 μL。结果 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1分别在0.0300～0.3000，0.1201～1.2009，0.1200～1.1997 μg范围内线性关系良好，方法重复性及回收率均符合要求，平均加样回收率(n=6)分别为100.43%、100.65%、98.74%，RSD值分别为1.51%、1.30%、1.03%。按测定的方法测定市售2种丹七片的含量相近。结论 该方法简便、高效、准确、重复性好，分析速度提高近8倍，可以用于测定丹七片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的含量。

丹七片；ULPC；三七皂苷R1；人参皂苷Rg1；人参皂苷Rb1；含量测定

丹七片为卫生部药品标准收载的品种，由丹参和三七两味药材组成，功能为活血化瘀，临床上用于血瘀气滞，心胸痹痛，眩晕头痛，经期腹痛[1]。据国家食品药品监督管理总局数据显示，现有丹七片生产批号41个，对丹七片中三七成分的质量控制，药典[2]及许多杂志收载了采用高效液相色谱法[3-8,10-12]和薄层扫描色谱法[9]测定三七中的人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1的含量，但分析速度慢，溶剂消耗量。超高效液相色谱(ultra performance liquid chromatography，UPLC)，与传统的HPLC技术相比，不仅比传统HPLC具有更高的分离能力，而且结束了人们多年不得不在速度和分离度之间取舍的历史。使用UPLC可以在很宽的线速度、流速和反压下进行高效的分离工作，并获得优异的结果。已有学者采用UPLC法[13]测定三七药材中3种皂苷的含量，但未见采用此法对丹七片中3种皂苷同时测定的报道。因此，为高效控制丹七片的质量，本实验采用UPLC对其进行含量测定，为丹七片的质量控制提供新方法。

1 材料与方法

1.1 试药与仪器 三七皂苷R1对照品(广州齐云生物科技有限公司；批号140629、130410)；丹七片样品1(北京某制药厂，批号 12121276)；丹七片样品2(福州某药业有限公司，批号13070111)；人参皂苷Rg1对照品(中国药品生物制品检定所，批号131210)；人参皂苷Rb1对照品(中国药品生物制品检定所批号，140316)。乙腈 (MERCK，HPLC级)，水(屈臣氏蒸馏水)，其他试剂均为分析纯。

Acquity UPLC System，包括四元泵处理器、样品处理器、柱温箱、PDA检测器及Empower色谱工作站(Waters公司)；超声仪(昆山市超声仪器有限公司，KQ-100，100 W，40 KHz)。

2 方法

2.1 对照品溶液的制备

2.1.1 混合对照储备溶液的制备:精密称取人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、三七皂苷R1对照品适量，加甲醇制成每1 mL分别含人参皂苷Rg11.6013 mg、人参皂苷Rb11.5996 mg、三七皂苷R10.3998 mg的混合储备溶液，即得。

2.1.2 混合对照溶液的制备：精密量取混合储备溶液适量，加甲醇制成每1 mL分别含人参皂苷Rg10.4003 mg、人参皂苷Rb10.3999 mg、三七皂苷R10.1000 mg的混合对照品溶液，即得。

2.2 供试品溶液的制备 取本品(批号12121276)10片，去包衣，研细，取粉末(过4号筛)约0.3 g，精密称定，置25 mL容量瓶中，精密加入50%甲醇25 mL，超声溶解，滤过，取续滤液，即得。

2.3 阴性对照溶液的制备 取丹参药材10 g，用90%的乙醇提取2次，第1次用6倍量的乙醇提取1 h，第2次用4倍的乙醇提取0.5 h，将提取液减压浓缩至稠膏。药渣用6倍量的水提取2次，每次120 min，提取液浓缩至稠膏。向稠膏中以1:1量加入淀粉，混匀后放入60 ℃的烘箱中烘干，研磨成粉末，加入0.3%的硬脂酸镁混匀，过四号筛，取粉末0.3 g，按“2.2”项下方法制得阴性对照品溶液。

2.4 色谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.8 μm)，柱温30 ℃，以乙腈(A)-水(B)为流动相，梯度洗脱[乙腈-水体积比(下同)，0～5 min, 20:80～40:60; 5～7 min, 40:60～20:80; 7～10 min, 20:80]，流速0.3 mL/min，检测波长203 nm[2]，进样体积2 μL。分别精密吸取混合对照品和供试品溶液2 μL，按上述色谱条件进行进样分析。结果三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1与相邻峰的分离度分别为56.98、4.67、31.71，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的理论塔板数分别为25043、30043、73979。

2.5 线性关系考察 分别精密吸取混合对照溶液0.1、0.3、0.5、1、2、3、4 μL7份，注入超高效液相色谱仪，依法测定，记录色谱图。以进样量(x)为横坐标，峰面积积分值(y)为纵坐标进行线性回归。见表1。

表1 3种皂苷对照品溶液的回归方程

2.6 专属性试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液，分别按上述色谱条件进样2 μL，依法测定。结果阴性对照溶液无干扰，见图1。

图1 对照品、阴性对照品和供试品溶液的UPLC图谱1.三七皂苷R1；2.人参皂苷Rg1；3.人参皂苷Rb1Fig.1 UPLC chromatogram of reference substance,negative reference substance and sample substance solution1.notoginsenoside R1; 2.ginsenoside Rg1; 3.ginsenoside Rb1

2.7 精密度 取同一浓度的对照品溶液和供试品溶液，重复进样6次，分别记录三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的峰面积，照上述色谱条件测定。结果，对照品溶液的RSD分别为 0.28%、0.14%、0.19%，供试品品溶液的RSD分别为0.78%、0.84%、0.29%，表明仪器精密度良好。

2.8 稳定性试验 取同一批丹七片样品(批号12121276)粉末，按“2.2”项下制备供试品溶液，室温下放置，按上述色谱条件分别在0、2、4、6、8 h测定。结果，三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的RSD分别为1.56%、0.41%、1.08%，表明供试品溶液在8 h内稳定。

2.9 重现性试验 分别取同一批号样品(批号12121276)6份，按“2.2”项下制备供试品溶液，照上述色谱条件测定，计算含量。结果, 三七皂苷R1、人参皂苷Rg1和人参皂苷Rb1的平均含量分别为4.82900、25.19850、18.22495 mg/g, RSD分别为 0.33%、0.60%、0.63%，表明方法重现性良好。

2.10 回收率试验 精密量取已知含量的供试品 (批号12121276 )，按“2.2”项下制备供试品溶液，于25 mL量瓶中，精密加入对照品溶液，其中三七皂苷R10.80458 mg、人参皂苷Rg12.38287 mg和人参皂苷Rb12.40933 mg，摇匀，平行制备6份供试品溶液，进样，测定结果。

表2 丹七片中3种皂苷的加样回收率试验结果

2.11 样品的含量测定 取2批丹七片，按测定方法操作，测定3次，计算人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1和三七皂苷R1的含量，批号12121276丹七片3种皂苷的平均含量分别为24.9923 mg/g、18.2749 mg/g、4.9826 mg/g，批号13070111丹七片3种皂苷的平均含量分别为25.8095 mg/g、18.3795 mg/g、4.6716 mg/g。本文所测的2个批号的丹七片含量接近，且符合含量标准。

3 讨论

与HPLC法相比，UPLC在不影响分离效果的情况下可显著提高丹七片中三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1的分析速度，6 min之内即可将丹七片中3种待测成分完全分离，分析速度提高近8倍，改善分析效果，同时可减少溶剂的消耗。该方法简便、高效、准确、重复性好。表明UPLC适合中药成分复杂体系的分离分析，是一种值得推广应用的绿色环保检测技术。

[1] 国家药典委员会.国家卫生部药品标准中药成方制剂(第1册)[S].1989: 48.

[2] 国家药典委员会.中国人民共和国药典[S].一部.北京: 中国医药科技出版社，2010: 11-12.

[3] 梁少强，谢仕伟，李国荣，等.丹七片质量标准的研究[J].中国医药指南，2009，7(24): 57-60.

[4] 郑文忠，邓红，林华庆，等.丹七片HPLC指纹图谱[J].中国实验方剂学杂志，2014，20(10): 80-83.

[5] 韩桂茹，张少杰，姚振林，等.丹七片中4种成分的HPLC定量测定[J].中成药，2005，27(11): 1259-1263.

[6] 夏新中，李万江.三七片中3种皂苷成分的提取方法的改进[J].长江大学学报(自然科学版)，2011，8(9): 201-202.

[7] 朱奇，程建彤，叶水利，等.二种三七片伪品的HPLC法鉴别[J].湖北中医杂志，2010，32(12): 76-77.

[8] 李卓，邓桂明，郭昱，等.复方三七片质量标准研究[J].湖南中医药大学学报，2011，31(11): 34-37.

[9] 梁少强，朱颖虹，罗小英，等.三七片中人参皂苷 Rb1和人参皂苷 Rg1的含量测定[J].中药材，2003，26(9): 671-672.

[10] 张小平，徐世杰.梯度洗脱高效液相色谱法测定三七片中三七总皂苷的含量[J].中国现代应用药学杂志，2006，23(3): 219-221.

[11] 余爱红;晏红星.三七片含量测定[A];2011年全国医药学术论坛交流会暨临床药学与药学服务研究进展培训班论文集[C];2011.

[12] 俞坚，刘杭，王京霞.高效液相色谱法测定三七片中三七皂苷 R1和人参皂苷 Rg1的含量[J].中华中医药学刊，2008，26(2): 421-422.

[13] 谢耀轩，林亚珠.超高效液相色谱法测定三七片中人参皂苷 Rg1、人参皂苷 Rb1和三七皂苷 R1的含量[J].广东药学院学报 2011，27(5): 489-492..

(编校：王冬梅)

Content determination of notoginsenoside R1, ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in Danqi tablets by UPLC

SUN Ying-ying1,GUO Yu-hai2,LIN Hua-qing1,YU Chu-qin1,ZHANG Lun1,LUO Cheng-jia1

(1.Drug Research Institute,Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China; 2.Department of Orthopedics,Guangdong Hospital of Traditional Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

ObjectiveTo establish a method to determine the content of notoginsenoside R1,ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in Danqi tablets by ultra performance liquid chromatography(UPLC).MethodsACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×50 mm，1.8 μm)column was used with mobile phase consisted of acetonitrile (A)-water(B)by gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min and a column temperature of 30 ℃,the wavelength of detector was 203 nm,the injection volume was 2 μL.ResultsNotoginsenoside R1,ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1had good linearity within the range of 0.0300-0.3000,0.1201-1.2009,0.1200-1.1997 μg respectively.The average recoveries(n=6)were 100.43%,100.65%,98.74% and RSDs were 1.51%,1.30%,1.03%，respectively.According to the content determination method for the determination of two Danqi tablets sample were similar. ConclusionUPLC method is more convenient,efficient,accurate and excellent repeatability,analysis is nearly eight times faster,can be used for determination of notoginsenosideR1,ginsenoside Rg1and ginsenoside Rb1in Danqi tablets.

Danqi tablet; ULPC; notoginsenoside R1; ginsenoside Rg1; ginsenoside Rb1; content determination

国家自然科学基金(81271625)

孙英英，女，在读硕士，研究方向：药剂学研究，E-mail：18814099672@163.com；林华庆，通讯作者，男，教授，研究方向：药物新剂型研究，E-mail：huaqing_@vip.tom.com。

R914.1

A

1005-1678(2015)01-0148-03