壳聚糖介导HMGB1的siRNA对脓毒症大鼠肝肺中细胞因子的影响研究

周凯,胡迎春

(泸州医学院附属医院 急诊科，四川 泸州 646000)



壳聚糖介导HMGB1的siRNA对脓毒症大鼠肝肺中细胞因子的影响研究

周凯1,胡迎春2

(泸州医学院附属医院 急诊科，四川 泸州 646000)

目的 以壳聚糖纳米粒介导HMGB1的siRNA基因表达载体治疗脓毒症大鼠，为基因药物研发及其临床应用奠定实验基础和提供理论依据。方法 60只雄性SD大鼠，分成正常组、阴性组、模型低浓度组、模型中浓度组、模型高浓度组5组，每组12只。正常组行假手术，其余各组大鼠均行盲肠结扎穿孔术(CLP)构建脓毒症模型；正常组在大鼠尾静脉注射生理盐水、阴性组注射单纯纳米粒，各浓度模型组注射不同浓度的壳聚糖- pGenesil-HMGB1混合微粒。ELISA检测各组大鼠肝、肺组织炎症因子IL-6、IL-10、TNF-α的表达，观察比较各组大鼠存活率。结果 与正常组相比，阴性组肝肺组织中IL-6、TNF-α表达显著升高(P<0.05)，而IL-10表达差异无统计学意义；各治疗组IL-6、TNF-α表达显著降低(P<0.05)，而IL-10表达升高(P<0.05)；高浓度组大鼠生存率优于中浓度组和低浓度组(P<0.05)。结论 壳聚糖纳米粒联合基因治疗技术能够显著降低脓毒症大鼠肝肺组织中TNF-α、IL-6的表达，上调其抗炎细胞因子IL-10的表达，显著提高了脓毒症大鼠的存活率。该技术有望形成制备新的基因药物的治疗体系，提高脓毒症患者的生存率。

脓毒症；基因治疗；纳米技术；细胞因子

脓毒症是严重创伤、烧伤、休克、感染、外科大手术后常见的并发症，是由于感染而导致的全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)的临床表现。属于临床常见急危重症，如不能及时有效处理可合并多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)。本病死率约30%，而重症脓毒血症和感染性休克患者病死率更高，其报道约20%～52%[1]。但现有的临床治疗方法有限，迫切需要新的治疗药物、方式、以及新的治疗体系。因此，找到新的药物以及构建安全、高效和靶向性治疗体系成为医学发展的方向。

随着现代科学的发展，纳米技术联合基因治疗技术让广大医学工作者看到了治疗脓毒症的新希望，或可提高患者的生存率以及对预后带来巨大收益[2]。本研究采用壳聚糖纳米粒联合基因治疗技术治疗脓毒症，旨在通过测定脓毒症大鼠肝、肺组织的炎症因子表达情况，观察大鼠存活率情况，为防治脓毒症提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物：雄性SD大鼠60只，平均体质量(300±15)g，健康状况良好，常规饲养。由泸州医学院实验动物中心提供，动物合格证号：2401217。本实验遵循《实验动物保护条例》。

1.1.2 主要试剂：壳聚糖(C12H24N2O9，Sigma-Aldrich公司)、质粒pGenesil(武汉晶赛公司)、盐酸氯胺酮(上海第一生化药业有限公司)、离心机(Eppendorf德国)、ELISA试剂盒(美国 ADL公司)。

1.2 方法

1.2.1 制备壳聚糖-质粒：pGenesil-HMGB1武汉晶赛公司合成HMGB1重组干扰载体pGenesil-HMGB1。取500mg壳聚糖溶解于1%乙酸溶液，超声震荡至澄清，121 ℃高压灭菌20 min备用。pGenesil-HMGB1溶解于灭菌 20%Na2SO4溶液中。0.5%的壳聚糖与等体积的pGenesil-HMGB1溶液混合，在漩涡混合器上充分混匀后，12000 r/min、4 ℃离心20 min，沉淀物以PBS重悬，此为壳聚糖- pGenesil-HMGB1微粒混悬液。

1.2.2 动物模型制备与分组：雄性SD大鼠60只，随机分为正常组、阴性组、模型低浓度组、模型中浓度组、模型高浓度组，每组各12只。实验前适应性饲养1周后，禁食过夜，自由饮水。正常组行假手术，其余各组均行盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症。以40 mg/kg盐酸氯氨酮腹腔注射麻醉后固定，沿腹正中线作1.5 cm切口，结扎盲肠根部(避免结扎回肠及盲肠系膜血管)，用18号针穿刺盲肠4次，之后将盲肠还纳腹腔，逐层缝合腹壁切口。各浓度模型组用24 G的静脉套管针尾静脉分别注射5、10、15 mg/kg壳聚糖- pGenesil-HMGB1混合微粒，在10 s内完成注射，即模型低浓度组、模型中浓度组和模型高浓度组。阴性组造模后注射单纯纳米粒。正常组行假手术，即开腹后挤压盲肠数次后关腹，该组给予注射生理盐水。

1.2.3 观测指标：在大容量壳聚糖- pGenesil-HMGB1纳米粒溶液尾静脉注射后，分别于1、4、8提取大鼠肝、肺组织各50～100 mg。酶联免疫吸附法(ELISA法)分析炎症介质IL-6、IL-10、TNF-α的表达情况，操作方法按照试剂盒说明进行。同时，观察脓毒症大鼠在尾静脉注射壳聚糖-pGenesil-HMGB1纳米粒后0、12、24、36、48、72 h存活率。

2 结果

2.1 TNF-α在脓毒症大鼠肝、肺组织中的表达比较 与正常组相比，阴性组肝、肺组织中TNF-α表达显著升高趋势(P<0.05)，随时间变化无显著趋势；CLP后模型高、中、低浓度组肝肺中TNF-α表达均增加。与阴性组相比，而模型低、中、高浓度组、表达显著降低(P<0.05)。各模型浓度组4d及8d后TNF-α表达逐渐降低。见表1。

表1 TNF-α在各组大鼠肝肺中表达比较

#P<0.05，与正常组相比，compared with normal group；△P<0.05，与阴性组相比，compared with negative group

各组大鼠肝脏中IL-6表达与TNF-α表达相似，但各模型浓度组大鼠4 d后仍有IL-6表达的升高，8 d时降低。各组大鼠在1 d和8 d肺脏中IL-6表达差异无统计学意义，在4 d时阴性组、模型低浓度组、模型中浓度组表达升高，与正常组、模型高浓度组差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 IL-6在各组大鼠肝肺中表达

#P<0.05，与正常组相比，compared with normal group；△P<0.05，与阴性组相比，compared with negative group；*P<0.05，与高浓度组比较，compared with high concentration group

正常组与阴性组大鼠IL-10浓度相比差异无统计学意义；与正常组相比，模型高、中、低浓度组大鼠IL-10在肝肺中表达升高(P<0.05)，差异有统计学意义。模型高浓度组肝肺组织中IL-10表达显著高于中浓度和低浓度组(P<0.05)。见表3。

表3 IL-10在各组大鼠肝肺中表达

#P<0.05，与正常组相比，compared with normal group；△P<0.05与阴性组相比，compared with negative group；*P<0.05，与高浓度组比较，compared with high concentration group

2.2 各组存活率比较 术后72 h内，正常组大鼠没有死亡，阴性组在36 h内死亡数为6，随后至72 h没有死亡。CLP各组死亡高峰为0～12 h内。注射高浓度壳聚糖- pGenesil-HMGB1纳米粒脓毒症大鼠72 h存活率较低浓度显著升高(P<0.05)，高浓度组较中浓度组、中浓度组较低浓度存活率显示不同程度的提高，但差异无统计学意义。见表4。

表4 各组大鼠不同时间段存活率比较[n(%)]

#P<0.05，与正常组相比，compared with normal group；△P<0.05，与阴性组相比，compared with negative group

3 讨论

脓毒症累及器官所致的损伤有不同程度倾向性，如最早最容易累及的器官是肺[3]，而最早出现能量代谢障碍的器官是肝[4]，并且肝肺中有大量的炎症细胞，这些细胞因子的过度激活与脓毒症的发展和预后有密切的关系，有利于从细胞因子角度探索脓毒症的临床治疗方法。急慢性疾病等许多原因都可导致机体细胞因子的产生，这对于机体正常防御具有重要的意义[5]。但当过于强烈的刺激导致细胞因子产生过多时，则可能引起广泛的损伤[6]。

一般情况下细胞因子可分为促炎细胞因子和抗炎细胞因子。TNF-α、IL-1β、IL-6等为促炎细胞因子，IL-4、IL-10、转化生长因子(TGF-β)等为抗炎细胞因子。促炎细胞因子能够促进一氧化氮、花生四烯酸、组胺等的产生，还能激活补体系统等，并可以相互作用，形成级联反应的“细胞因子网络”[7]，导致炎症反应的加重。抗炎细胞因子能够抑制促炎细胞因子的产生，影响单核细胞抗原提呈的能力，抑制T细胞和B细胞的活性等[8-9]，这对于维持机体内细胞因子网络的平衡具有重要的作用。

细胞因子主要来源于巨噬细胞，而肝脏和肺脏中存在大量的巨噬细胞，血清中的细胞因子水平难以准确反映肝肺局部的细胞因子水平[10]。所以，只有检测组织局部细胞因子水平才能准确的反映局部炎症反应的严重程度。本研究中采用盲肠结扎穿孔术(CLP)致脓毒症，结果发现阴性组大鼠肝肺组织中TNF-α、IL-6表达显著升高，而IL-10较正常组没有显著变化，提示阴性组抗炎细胞因子并未发挥相应作用。

基因转移是基因治疗的关键技术，也是制约其成功开展的瓶颈问题。传统的基因转移系统分为2大类：病毒载体系统和非病毒载体系统。病毒载体系统是至今为止最有效的基因转移方法。其基因转移效率通常在90%以上，目前75%以上的基因治疗临床试验中仍采用病毒载体[11]。然而，由于病毒载体自身的局限性，如载体的免疫原性和有限的基因载量，尤其是存在安全性问题，使其进一步的应用受到一定的限制和更为严格的控制。非病毒载体系统虽然无安全隐患，但其转染效率不如病毒载体系统。因此，突破基因转移瓶颈已成为基因治疗领域的当务之急[12]。随着纳米技术的发展，人们开始研究纳米基因载体，其系统内和细胞内基因转移机理得到深入阐明[13]。设计与研制体内循环时间长，具有靶向特异的纳米基因载体为突破基因治疗的瓶颈，实现安全、高效和靶向性基因治疗带来了新的希望。

以纳米颗粒作为基因转移载体就是将DNA、RNA、PNA(肽核苷酸)、dsRNA(双链RNA)等治疗基因包裹在纳米颗粒中或吸附在其表面，在细胞摄粒作用下，纳米颗粒进入细胞内，释放治疗基因，进而发挥其基因治疗效能[14-15]。本研究采用壳聚糖纳米粒介导HMGB1的siRNA基因表达载体治疗脓毒症大鼠。研究结果显示，模型高、中、低浓度组能够显著降低脓毒症大鼠肝肺组织中TNF-α、IL-6的表达，上调其抗炎细胞因子IL-10的表达，显著提高了脓毒症大鼠的存活率，并且高浓度组治疗作用优于中浓度组和低浓度组。

综上所述，壳聚糖纳米粒联合基因治疗技术治疗脓毒症，符合现代医学的研究方向和特点，有望形成制备新的基因药物的治疗体系，可提高脓毒症患者的生存率以及对预后带来巨大收益。

[1] 盛志勇，姚咏明.脓毒症与多器官功能障碍综合征[J].中华急诊医学杂志，2003，12(10)：653-654.

[2] 王丽亚，郝娜，刘亢丁.纳米技术在临床医学中的应用现状和展望[J].中风与神经疾病杂志，2013，30(8)：764-765.

[3] Deitch EA.Multiple organ failure: pathophysiology and potential future therapy[J].Ann Surg,1992,216(2): 117- 134.

[4] 孟宪钧.肝脏在多器官功能衰竭发生中的作用[J].中华医学杂志，1988，6(8)：191-193.

[5] 吴荣谦，宋旭华，徐迎新，等.促炎症和抗炎症细胞因子基因表达与脓毒症小鼠肝损伤的关系[J].中华普通外科杂志，2001，16(2)：103-105.

[6] 姚咏明，盛志勇，林洪远，等.脓毒症定义及诊断的新认识[J].中国危重病急救医学，2004，16(6)：321-324.

[7] Annane D,Bellissant E.Cavaill on JM1Sep tic shock[J].Lancet,2005, 365 (9453): 63-78.

[8] Pachot A,Monneret G,Voirin N,et al.Longitudinal study of cytokine and immune transcription factor mRNA expression in septic shock[J].Clinical Immunology,2005,114 (1): 61-69.

[9] Gogos CA,Drosou E,Bassaris HP,et al.Pro-versus anti-inflammatory cytokine profile in patients with severe sepsis: a marker for prognosis and future therapeutic options[J].J Infec Dis,2000,181(1): 176-1801.

[10] 韩涛，邓勇，樊海宁.脓毒血症与细胞因子研究进展[J].中国现代医药杂志，2011，13(7)：116-119.

[11] Van Craynest N,Santaella C,Boussif O,et al.Polycationic telomers and cotelomers for gene transfer: synthesis and evaluation of their an vitro transfection efficiency[J].Bioconjug Chem，2002,13(1):59-75.

[12] Jackson DA,Juranek S,Lipps HJ.Designing nonviral vectors for efficient gene transfer and long-term gene expression[J].Mol Ther,2006，14(5):6136-26.

[13] Mansouri S,Lavigne P,Corsi K,et al.Chitosan-DNA nanoparticles as non-viral vectors in gene therapy: strategies to improve transfection efficacy[J].Eur J Pharm Biopharm,2004,57(1):1-8.

[14] Boerma EC.The microcirculation as a clinical concept:work in progress[J].Curr Opin Crit Care,2009,15(3):261-265.

[15] Balestra GM,Legrand M,Ince C.Microcirculation and mitochondria in sepsis:getting out of breath[J].Curr Opin Anaeesthesiol,2009,22(2):184-190.

(编校：吴茜)

Effect of chitosan mediated HMGB1 siRNA on cytokines in liver and pulmonary of sepsis rat

ZHOU Kai1,HU Ying-chun2

(Department of Emergency, Affiliated Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China)

ObjectiveTo observe the effect of chitosan nanoparticles mediated HMGB1 siRNA gene expression vector in treatment of sepsis rats, in order to provide clinical application experiment foundation and provide theoretical evidence for gene drugs.Methods60 male SD rats were divided into 5 groups：normal group，negative group，model low concentration group，model moderate concentration group，model high concentration group，each had 12 rats.Except normal group，the other groups were made the cecum ligation perforation technique (CLP) to cause sepsis，and different concentration of chitosan-pGENESIL-HMGB1 hybrid particles were injected into the caudal vein of rats.Normal group were injected with saline and negative group were given nanoparticles.The expression levels of cytokines such as IL-6，IL-10，TNF-α in liver and pulmonary of sepsis rats were detected by ELISA and survival rate of rats were observed.ResultsCompared with normal group，the expression levels of IL-6，TNF-α in liver and pulmonary tissue of negative group increased significantly(P< 0.05)，while the expression levels of IL-10 had no significant difference.The expression levels of IL-6, TNF-α in each treatment group were significantly reduced(P<0.05)，whereas the expression of IL-10 significantly increased(P<0.05).The survival rates of high concentration model group were higher than low concentration model group and moderate concentration model group(P<0.05). ConclusionChitosan nanoparticles combine gene therapy technique can significantly reduce the expression of liver and lung tissue TNF- α and IL-6 in septic rats, upregulation the expression of the anti-inflammatory cytokine IL-10, significantly increased the survival rate of rats with sepsis.It is expected to form the preparation of new gene drug treatment system，and will improve the survival rates of patients with sepsis.

sepsis; gene therapy; nanotechnology; cytokines

四川省卫生厅科研课题(130353)

周凯，男，本科，主治医师，研究方向：重症医学，E-mail：59727372@qq.com。

R459.7

A

1005-1678(2015)01-0077-04