丙氨瑞林对子宫内膜癌Chk1/2和Plk1蛋白表达的影响研究

刘韵,兰艳丽

(湖北文理学院附属襄阳市中心医院 妇产科，湖北 襄阳 441021)



丙氨瑞林对子宫内膜癌Chk1/2和Plk1蛋白表达的影响研究

刘韵,兰艳丽

(湖北文理学院附属襄阳市中心医院 妇产科，湖北 襄阳 441021)

目的 本文分析子宫内膜癌患者Chk1/2和Plk1蛋白的表达变化及其相关性，并探讨丙氨瑞林治疗相关机制。方法 本文采用Real-time PCR及Western blot分析本院2009年5月～2013年5月诊治的40例子宫内膜癌患者接受丙氨瑞林治疗后肿瘤组织中Chk1、Chk2、Plk1、Bcl2和Bax蛋白及caspases 3表达的差异性，并采用Spearman对plk1,Chk1,Chk2进行等级相关性分析。并以30例子宫内膜癌患者的肿瘤组织及癌旁组织为对照。结果 研究显示Chk1、Chk2、PIk1及Bcl2蛋白在子宫内膜癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.01)，而促凋亡蛋白Bax及caspase3表达明显低于癌旁组织中的表达，且差异具有统计学意义(P<0.01)，而丙氨瑞林治疗后子宫内膜癌组织的上述蛋白异常表达均得到部分恢复。相关性分析显示PIk1表达与Chk1和Chk2的表达具有正相关性。结论 丙氨瑞林通过抑制子宫内膜癌组织上调的Chk1、Chk2、PIk1及Bcl2蛋白及下调的Bax及caspase3发挥抑制子宫内膜癌的作用。

子宫内膜癌；丙氨瑞林；细胞凋亡；细胞周期检测点激酶

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，多发于绝经期和绝经后女性上皮组织，是仅次于卵巢癌和宫颈癌的引起死亡的妇科肿瘤[1-3]。子宫内膜癌的发病原因尚不明确，根据生物学行为特点一般分为雌激素依赖型和非雌激素依赖性[4-5]。细胞周期检测点激酶(checkpoint kinase 1 and 2，Chk1/2)可对肿瘤放疗及化疗过程导致的DNA损伤进行修复，是细胞周期检测点发挥主要作用的蛋白激酶[6-8]。Polo-like激酶(polo-like kinasel,PIk1)也可促使DNA修复，其主要在细胞分裂的M期发挥作用。细胞凋亡是细胞的程序化死亡过程，与肿瘤的生长、分化、增殖及转移和侵袭过程密切相关[9-11]。目前对细胞周期检测点蛋白在子宫内膜癌发病中的研究报道较少。本研究采用Real-time PCR及Western Blotting方法分析子宫内膜癌及癌旁组织中Chk1/2和Plk1 蛋白及其mRNA的表达变化及其相关性，并探讨丙氨瑞林治疗子宫内膜癌的相关机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究对本院2009年5月～2013年5月期间诊治的40例接受丙氨瑞林治疗后的子宫内膜癌患者行手术切除，术后经病理科检查证实均为子宫内膜癌样本。研究中剔除内分泌疾病患者、代谢疾病患者及自身免疫性疾病患者。40例患者中Ⅰ期26例，Ⅱ期10例，Ⅲ期4例，Ⅳ期0例。并以30例子宫内膜癌患者的肿瘤组织及癌旁组织为对照。2组患者在性别比例、年龄及肿瘤分期方面无统计学差异性。

1.2 Real-time PCR检测相关蛋白的表达 荧光定量PCR(qRT-PCR)的扩增体系为2×qPCR Mix 5 μL，上游和下游引物各10 pmol，模板cDNA 2 μL，dH2O 1 μL，共10 μL。反应条件：95 ℃10 s，60 ℃ 40 s，共28个循环。2%琼脂糖凝胶电泳及熔解曲线鉴定qRT-PCR产物，并用公式(ΔCt)进行定量分析。ΔCt=目的基因Ct-内参基因Ct。Real-time PCR引物序列如下：β-actin forward 5’-GGGAAATCGTGCGTGACAT-3’；Reverse 5’-CAGGAGGA-GCAATGATCTT-3’； Bax forward 5’-CCCGAGAGGTCTTTTTC-CGAG-3’；Reverse 5’-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3’；Bcl2 forward 5’-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3’;Reverse 5’-ACAG-TTCCACAAAGGCATCC-3’； caspase3 forward 5’-GACTCTGGAA-TATCC-CTGGgACAACA-3’;Reverse 5’-AGGTTTGCT-GCATCG-ACATCTG-3’。

1.3 Western blot检测相关蛋白的表达 子宫内膜癌及癌旁组织于冰水浴中进行充分匀浆，考马斯亮蓝法蛋白定量后以等量蛋白进行SDS-PAGE和半干法转膜。转至硝酸纤维素膜上后以1% BSA封闭2 h。然后与一抗温孵24 h，PBS缓冲液漂洗3次后与HRP标记二抗 (1:200)室温反应4 h，显色。用凝胶成像分析系统测定光密度，以β-actin作为参照，进行蛋白表达的定量分析。

2 结果

2.1 子宫内膜癌及癌旁组织Chk1及Chk2的表达变化 本研究发现，子宫内膜癌组织中Chk1及Chk2的表达均明显高于癌旁组织中的表达，且差异具有统计学意义(P<0.01)。而丙氨瑞林可以显著抑制上调的Chk1及Chk2蛋白，且其表达与肿瘤组织相比，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图1。

图1 子宫内膜癌及癌旁组织Chk1及Chk2的表达变化**P<0.01，与癌旁组织相比；##P<0.01，与肿瘤组织相比Fig.1 Changes of expression of Chk1 and Chk2 in endometrial carcinoma and adjacent tissue**P<0.01，compared with adjacent tissues；##P<0.01，compared with tumor tissue

2.2 子宫内膜癌及癌旁组织PIk1的表达变化 本研究发现，子宫内膜癌组织中PIk1的表达均明显高于癌旁组织中的表达，且差异具有统计学意义(P<0.01)。而丙氨瑞林可以显著抑制上调的PIk1蛋白，且其表达与肿瘤组织具有统计学意义(P<0.01)，见图2。

2.3 子宫内膜癌及癌旁组织促凋亡蛋白Bax及caspase3的表达变化 本研究发现，子宫内膜癌组织中促凋亡蛋白Bax及caspase3的表达均明显低于癌旁组织中的表达，且差异具有统计学意义(P<0.01)。而丙氨瑞林可以显著抑制下调的Bax及caspase3蛋白，且差异具有统计学意义(P<0.01)，见图3。

图3 子宫内膜癌及癌旁组织Bax及caspase3的表达变化。**P<0.01，与癌旁组织相比；##P<0.01，与肿瘤组织相比Fig.3 Changes in expression of Bax and caspase3 in endometrial carcinoma and adjacent tissue**P<0.01，compared with adjacent tissues；##P<0.01，compared with tumor tissue

2.4 子宫内膜癌及癌旁组织抑制凋亡蛋白Bcl2蛋白的表达变化 本研究发现，子宫内膜癌组织中抑制凋亡蛋白Bcl2的表达均明显高于癌旁组织中的表达，且具有统计学意义(P<0.01)。而丙氨瑞林可以显著抑制上调的Bcl2蛋白，且具有统计学意义(P<0.01)，见图4。

图4 子宫内膜癌及癌旁组织Bcl2的表达变化**P<0.01，与癌旁组织相比；##P<0.01，与肿瘤组织相比Fig.4 Changes in expression of Bcl2 in endometrial carcinoma and adjacent tissue**P<0.01，compared with adjacent tissues；##P<0.01，compared with tumor tissue

2.5 子宫内膜癌PIk1与Chk1和Chk2的相关性分析 本研究发现，在不同分期的子宫内内膜癌组织中，PIk1和Chk1/2的表达具有正相关性，且在III期子宫内膜癌中的相关系数为1，见表1。

表1 子宫内膜癌组织中PIk1与Chk1和Chk2的相关性分析

3 讨论

子宫内膜癌是多发于绝经期女性子宫内膜的上皮性恶性肿瘤，是妇科肿瘤中导致死亡的重要种类。子宫内膜癌的发病率和死亡率有逐年升高的趋势，但是其发病机制尚未完全阐明。子宫内膜癌在极早期无明显症状，随后便出现阴道不规则出血、阴道排液增加和阵发性下腹痛[12-13]。本研究采用实时定量PCR和Western blot方法分析子宫内膜癌患者Chk1/2和Plk1蛋白的表达变化及其相关性，并探讨丙氨瑞林治疗相关机制，结果发现子宫内膜癌组织中Chk1、Chk2、PIk1及Bcl2蛋白及mRNA的表达明显高于癌旁组织(P<0.01)，而促凋亡蛋白Bax及caspase 3表达明显降低(P<0.01)。同时，丙氨瑞林治疗后子宫内膜癌组织的上述蛋白异常表达均得到部分恢复，且相关性分析也显示PIk1表达与Chk1和2的表达具有正相关性。因此，丙氨瑞林通过抑制子宫内膜癌组织上调的Chk1、Chk2、PIk1及Bcl2蛋白及下调的Bax及caspase 3发挥抑制子宫内膜癌的作用。

细胞周期检测点激酶是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，是细胞周期检测点激活途径的终端蛋白。当细胞受到外界不利刺激时，细胞周期检测点激酶可以激活细胞DNA的损伤检测点，阻滞细胞处于非分裂期，完成DNA损伤的修复[14]。本研究发现，子宫内膜癌组织中的Chk1、Chk2表达明显高于癌旁组织(P<0.01)，而丙氨瑞林可以显著下调增强的Chk1、Chk2表达(P<0.01)，提示子宫内膜癌肿瘤组织中存在较强的自我修复能力，能够抵抗化学治疗药物或放射治疗效果，而丙氨瑞林下调2者的表达，发挥抑制肿瘤生长的作用。这与本文中发现的子宫内膜癌组织中促凋亡蛋白Bax及caspase 3表达下调而抑制凋亡蛋白Bcl2表达上调抑制。以往的研究中也证实，化疗药物可以通过增强促凋亡蛋白如Bax及caspase家族表达、下调抑制凋亡蛋白Bcl2等表达发挥抗肿瘤的作用。本文中发现丙氨瑞林也具有增强促凋亡蛋白Bax及caspase 3、抑制Bcl2蛋白表达的作用，提示丙氨瑞林除了减弱肿瘤细胞DNA自我修复能力外，还可以直接抑制肿瘤上生长、促进肿瘤细胞凋亡的作用。PIk1也是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，主要参与了细胞分裂过程中心体的成熟以及染色体的分离过程，即主要作用于细胞分裂的M期[15-16]。本研究发现，子宫内膜癌组织中的PIk1表达也明显高于癌旁组织，而丙氨瑞林可以显著下调增强的PIk1表达。肿瘤放疗或化疗过程中，肿瘤细胞由于PIk1的作用而停留于M期，客观上减弱了放疗或化疗对肿瘤细胞的杀灭作用。本研究中也发现，子宫内膜癌组织中PIk1的表达明显高于癌旁组织，而丙氨瑞林可以明显降低增强的PIk1表达，提示丙氨瑞林也可以通过抑制PIk1表达、影响肿瘤细胞分裂周期而发挥抗肿瘤作用。这与以往的研究结论相一致[17-18]。

因此，丙氨瑞林通过抑制子宫内膜癌组织上调的Chk1、Chk2、PIk1及Bcl2蛋白及下调的Bax及caspase 3发挥抑制子宫内膜癌的作用。

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(编校：谭玲)

Study on effect of alarelin on the expression of Chk1/2 and PIk1 in endometrial cancer

LIU Yun,LAN Yan-Li

(Department of Obstetrics and Gynecology, Xiangyang Central Hospital Affiliated to Hubei College of Arts and Science, Xiangyang 441021, China)

ObjectiveTo investigate the expression and relationship of Chk1/2 and PIk1 in endometrial cancer as well as the therapeutic mechanism of alarelin.Methods40 cases of endometrial cancer patients who treated with alarelin in our hospital from May 2009 to May 2013 were analyzed in this research.The expression of Chk1, Chk2, PIk1 and Bcl2 as well as Bax and caspase were detected by Real-time PCR and Western blot.The relationship of Chk1, Chk2 and PIk1 was analyzed by Spearman.ResultsThe results showed that the expression of Chk1, Chk2, PIk1 and Bcl2 was up-regulated while the expression of Bax and caspase3 was down-regulated greatly in tumor tissue.The alarelin can normalize those parameters greatly with a statistical difference.Correlation analysis showed that the expression of PIk1 had positive correlation with Chk1 and Chk2 expression. ConclusionAlarelin suppresses the endometrial cancer by increasing Chk1, Chk2, PIk1 and Bcl2 and decreasing Bax and caspase3 expression.

endometrial cancer; alarelin; apoptosis; checkpoint kinase

刘韵，女，硕士，主治医师，研究方向：妇产科疾病诊断与治疗，E-mail：liuy12u@163.com；兰艳丽，通讯作者，女，硕士，主治医师，研究方向：妇产科疾病诊断与治疗，E-mail：lan9yl@163.com。

R737.33

A

1005-1678(2015)01-0103-04