苦参碱联合卡铂对人胃癌SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响

汪顺才 毛 玲 梁 靓 左 念 祝 寅江苏省句容市人民医院血液肿瘤科，江苏句容 212400

苦参碱联合卡铂对人胃癌SGC-7901细胞增殖及凋亡的影响

汪顺才 毛 玲 梁 靓 左 念 祝 寅
江苏省句容市人民医院血液肿瘤科，江苏句容 212400

[摘要]目的 探讨苦参碱联合卡铂对人胃癌SGC-7901细胞抑制增殖及诱导凋亡的机制。 方法 将体外培养人SGC-7901细胞分为对照组、苦参碱组（1.0mg/mL、2.0mg/mL、3.0mg/mL）、卡铂组（0.01mg/mL）及苦参碱联合卡铂组。MTT检测各组细胞增殖抑制率，FCM检测各组细胞凋亡率，RT-PCR检测各组细胞的CXCR4 mRNA表达。 结果 相同浓度苦参碱联合卡铂组增殖抑制率及凋亡率明显高于单药苦参碱组（P＜0.05）及其单药卡铂组（P＜0.05）。与对照组比较，各实验组CXCR4mRNA灰度值均降低（P＜0.05）。相同浓度苦参碱联合卡铂组灰度值明显低于单药苦参碱组（P＜0.05）及其单药卡铂组（P＜0.05）。 结论 苦参碱联合卡铂能发挥正协同作用人胃癌SGC-7901细胞，剂量依赖性的抑制其增殖并诱导凋亡，该作用可能与抑制细胞内CXCR4 mRNA 表达有关。

[关键词]人胃癌SGC-7901细胞；苦参碱；卡铂；趋化因子受体4

胃癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，早期患者大多无明显临床症状，通常发现时，都处于晚期[1]。化疗是目前治疗胃癌的主要手段。卡铂（carboplatin）为第二代铂类化疗药物，属于细胞周期非特异性抗肿瘤药物，广泛用于包括胃癌在内的实体瘤的治疗。然而，临床在追求疗效的同时，毒副作用也很明显[2]。中药苦参碱抗肿瘤作用近年受到学者广泛关注[3-6]，本实验采用不同浓度苦参碱联合卡铂作用于人胃癌SGC-7901细胞，观察苦参碱与卡铂是否有协同抗人胃癌SGC-7901细胞的作用及其作用机制。

1 实验材料

人胃癌SGC-7901细胞株购自中国科学院细胞库；苦参碱（粉末，纯度≥98%）购自中鑫科技生物有限公司；卡铂注射液（规格10Ml:100mg，齐鲁制药有限公司，H20020180）购自句容市人民医院；四甲基偶氮唑蓝（MTT）和二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma公司；Annexin-V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自北京宝赛公司；CXCR4mRNA、β-actin由艾博思生物工程技术服务有限公司设计及合成；自动酶联检测仪；流式细胞仪；电泳仪等。

2 方法

2.1细胞培养

SGC-7901细胞(细胞代数：P2）在RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清及1%青霉素-链霉素）中培养传代，5～7d传代1次。孵育箱培养条件：37℃，5%CO2，100%湿度。保持细胞处于指数生长期。

2.2分组

（1）（阴性）对照组：仅人SGC-7901细胞不经任何处理。（2）苦参碱1.0mg/mL组；（3）苦参碱2.0mg/mL组；（4）苦参碱3.0mg/mL组；（5）卡铂0.01mg/mL组；（6）苦参碱1.0mg/mL联合卡铂组；（7）苦参碱2.0mg/mL联合卡铂组；（8）苦参碱3.0mg/mL联合卡铂组。

2.3SGC-7901细胞增殖抑制率检测

将对数生长期1×104/mL的SGC-7901细胞，接种于96孔培养板中，按实验分组加药，作用24h。各组同时进行MTT分析，设阴性对照组，每组6个复孔，每孔加MTT（5mg/mL）20μL，孵育4h后吸去孔内上清液，每孔加150μL DMSO，震荡15min，1h内酶标仪测定各孔492 nm波长的吸光度( OD 值)。增殖抑制率=（1-实验组吸光度/对照组吸光度)×100%。

2.4SGC-7901细胞凋亡率检测

取对数生长期细胞，以1×105个/孔接种于六孔板中，按上述实验分组加药，作用24h。各组同时进行FCM检测。4℃预冷的PBS洗涤2次，1000rpm/min离心10min(离心半径 15cm)，重悬于200μL Binding Buffer中；加入10μL Annexin V-FITC后，室温避光15min，再加300μL Binding Buffer 及5μL PI 充分混匀，于1h内上流式细胞仪检测凋亡率。

2.5SGC-7901细胞CXCR4 mRNA表达检测

将细胞制成1×104/mL细胞悬液接种于50mL细胞培养瓶中。每组设3个样本。提取总RNA(Trizol Reagent法)，紫外分光光度计检测RNA纯度及完整性，以OD260/OD280在1.8～2.0之间为纯净RNA的标准。按说明书步骤逆转录mRNA为cDNA。PCR扩增：（1）CXCR4引物：产物大小为127bp。上游序列5’-CTGCCCTCCTGCTGACTATTCC-3’；下游序列5’-ATGATGTGCTGAAACTGGAACAC-3’。β-actin引物：产物大小为130bp。上游序列5’-CGAAACTACCTTCAACTCCATC-3’；下游序列为5’-AGTGATCTCCTTCTGCATCCT-3’。（2）引物及内参照扩增：反应条件：94℃预变性3min，94℃变性30s，56℃(CXCR4) /56℃(β-actin)退火30s，72℃延伸1min，共30个循环，最后72℃延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。利用电脑成像分析系统检测PCR产物与β-actin的积分光密度比值，半定量分析目的基因的表达。

2.6统计学分析

3 结果

3.1MTT检测苦参碱联合卡铂对SGC-7901细胞增殖抑制率的影响

随着单药苦参碱浓度（1.0～3.0mg/mL）的增高，抑制率逐渐增高（F=120.88，P＜0.05）。苦参碱（1.0～3.0mg/mL）联合卡铂组（0.01mg/mL）抑制率明显高于单药苦参碱组及单药卡铂组，具有浓度依赖性（P＜0.05）。表明苦参碱联合卡铂能发挥正协同作用抑制细胞增殖。见表1。

表1　各组细胞增殖抑制率及凋亡率（±s，%）

表1　各组细胞增殖抑制率及凋亡率（±s，%）

注：与对照组比较，aP＜0.05；与苦参碱1.0mg/mL组比较，bP＜0.05；与苦参碱2.0mg/mL组比较，cP＜0.05；d与苦参碱3.0mg/mL组比较，dP＜0.05；与卡铂组比较，eP＜0.05；与苦参碱1.0mg/mL+卡铂组比较，fP＜0.05g；与苦参碱2.0mg/mL+卡铂组比较，gP＜0.05。

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3.2 FCM检测苦参碱联合卡铂对SGC-7901细胞凋亡率的影响

各单药苦参碱组(1.0～3.0mg/mL)凋亡率均高于对照组，且随着苦参碱浓度的增高，凋亡率逐渐增高（F=52.05，P＜0.05）。苦参碱(1.0～3.0mg/mL)联合卡铂组（0.01mg/mL）凋亡率明显高于单药苦参碱组及单药卡铂组，具有浓度依赖性（P＜0.05）。表明苦参碱联合卡铂能发挥正协同作用诱导细胞凋亡。见表1。

3.3RT-PCR检测CXCR4 mRNA的表达

本实验对照组中灰度值比值为（0.86±0.03）高于（1.0～3.0mg/mL）苦参碱单药组（P＜0.01）。随苦参碱药物浓度增加，灰度值比值逐渐降低（分别为0.71±0.02、0.63±0.01、0.56±0.03，F=108.44，P＜0.01）。苦参碱（1.0～3.0mg/mL）联合卡铂组（0.01mg/mL）灰度值比值分别为（0.52±0.02、0.45±0.03、0.26±0.03）明显低于单药苦参碱组及单药卡铂组（0.61±0.07），具有浓度依赖性（P＜0.05）。表明苦参碱联合卡铂能发挥正协同作用抑制细胞增殖及诱导凋亡可通过降低CXCR4 mRNA 表达实现。见图1。

图1　细胞表达电泳图M：Marker；A：对照组 B：苦参碱1.0mg/mL组 C：苦参碱2.0mg/mL组 D：苦参碱3.0mg/mL组 E：卡铂 0.01mg/mL 组 F：苦参碱1.0mg/mL 联合卡铂组 G：苦参碱2.0mg/mL联合卡铂组 H：苦参碱3.0mg/mL 联合卡铂组

4 讨论

苦参碱（matrine）是从豆科植物中提取的活性成分。研究表明，苦参碱在抗肿瘤、抗炎、抗纤维化、抗病毒、保肝、抗过敏、抗心律失常等方面具有广泛的药理活性[7-11]。化疗虽是胃癌的主要治疗手段，相比单药化疗，联合中药方案能有效减轻传统化疗药物的副作用，并能提高疗效。研究发现，苦参碱联合顺铂能抑制神经母细胞瘤细胞增殖并诱导其凋亡，且能提高顺铂化疗的敏感性[12]。苦参碱联合阿霉素呈时间及剂量依赖性抑制乳腺癌细胞增殖及诱导凋亡，且证实苦参碱可作为抗癌药的化疗增敏剂[13]。目前苦参碱联合卡铂是否能发挥正协同作用人胃癌SGC-7901细胞，尚未有文献报道。

本实验通过MTT及FCM检测，发现苦参碱在1.0～3.0mg/mL浓度范围内能抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖并诱导其凋亡，呈剂量依赖性。随着苦参碱浓度的增高，抑制率及凋亡率逐渐增高。临床上，卡铂单药应用对人体造成相当大的毒副作用，如消化道反应：恶心、呕吐；骨髓抑制：中性粒细胞、血红蛋白及血小板计数下降；耳毒性：肾、膀胱、输尿管毒性：急性肾功能衰竭。从临床长期应用看，单药化疗效果不甚理想。本实验通过不同浓度（1.0～3.0mg/mL）苦参碱联合卡铂（0.01mg/mL）作用人胃癌SGC-7901细胞，发现联合组的抑制率及凋亡率明显高于单药苦参碱组及单药卡铂组，具有浓度依赖性。表明苦参碱联合卡铂能发挥正协同作用抑制人胃癌SGC-7901细胞增殖及诱导其凋亡。

胃癌的发病机制复杂，其发生及发展关系到癌基因的激活及抑癌基因的失活等。因此，检测胃癌相关基因的表达有助于胃癌的诊断、治疗及预后[14]。趋化因子（chemokines)通过作用于趋化因子受体参与白细胞浸润至肿瘤，刺激肿瘤细胞增殖及调节肿瘤相关血管生成。趋化因子受体4（CXC chemokine receptor 4，CXCR4) 为含有7个跨膜区的G蛋白耦联受体的超家族，由352个氨基酸组成[15-16]，在肿瘤细胞（如胃癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、结肠癌、甲状腺癌）中普遍表达，且在肿瘤的增殖、侵袭、浸润、播散、转移及免疫抑制等方面发挥重要作用[17-18]。研究发现CXCR4在胃癌组织中高表达，且在有淋巴结转移的胃癌组织表达更显著，可作为判断胃癌患者病程及预后的重要指标[19]。在胃癌的发生发展中，下调CXCR4mRNA表达可能成为治疗胃癌的新的靶点。

通过RT-PCR检测CXCR4mRNA表达，发现一定浓度范围内（1.0～3.0mg/mL）苦参碱组CXCR4mRNA表达低于对照组，具有剂量依赖性。苦参碱（1.0～3.0mg/mL）联合卡铂组（0.01mg/mL）CXCR4 mRNA表达明显低于单药苦参碱组及单药卡铂组，具有浓度依赖性。表明苦参碱联合卡铂能发挥正协同作用抑制细胞增殖及诱导凋亡可通过降低CXCR4 mRNA 表达实现。

综上，本实验条件下，一定浓度范围内苦参碱联合卡铂能发挥正协同作用人胃癌SGC-7901细胞，剂量依赖性的抑制其增殖并诱导凋亡，该作用可能与下调细胞内CXCR4 mRNA 表达有关。为目前尚无有效药物治愈胃癌提供实验依据。

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[中图分类号]R329.26

[文献标识码]A

[文章编号]2095-0616（2015）23-35-04

[基金项目]江苏大学医学临床科技发展基金项目（JLY20140074）

收稿日期：（2015-10-05）

Effects of matrine and carboplatin of proliferation and apoptosis in human gastric carcinoma SGC-7901 cells

WANG Shuncai MAO Ling LIANG Liang ZUO Nian ZHU Yin
Department of Hematology Oncology,Jurong People's Hospital,Jurong 212400,China

[Abstract]Objective To investigate the effects of matrine and carboplatin on the CXCR4 expression of proliferation and apoptosis in human gastric carcinoma SGC-7901 in vitro,and its potential mechanism. Methods SGC-7901 cells were treated with matrine(final concentrations=1.0,2.0 and 3.0mg/mL) and carboplatin(final concentrations=0.01mg/ mL),either each alone or in combination.The viability in treated SGC-7901 cells was assessed by MTT.Cell apoptosis of SGC-7901 was assessed by flow cytometry.CXCR4 mRNA abundance by RT-PCR. Results Matrine and carboplatin,either each alone or in combination,significantly increased inhibition rate (P＜0.05),significantly higher apoptotic rate(P＜0.05),and decreased CXCR4mRNA abundance(P＜0.05).The above effects of SGC-7901 cells were more pronounced when they were jointed in combination than they were used alone(P＜0.05). Conclusion Matrine and carboplatin in combination can signifcantly inhibit the proliferation and induce apoptosis of SGC-7901 cells in a dose-dependent manner,the observed effects of matrine may be related to decreased CXCR4 expression.

[Key words]SGC-7901;Matrine;Carboplatin;Chemokine receptor 4