瘦素在病理性瘢痕中的表达及临床意义

向小燕，蔡燕，周国富，黄佳佳

(1.川北医学院附属医院烧伤整形科;2.川北医学院附属医院检验科，四川 南充 637000)

病理性瘢痕包括增生性瘢痕和瘢痕疙瘩，是一种皮肤纤维化疾病。病理性瘢痕的存在，严重地影响着患者的身体健康及生命质量。对瘢痕的防治，一直是目前创伤修复研究的热点问题。瘦素(leptin)是由肥胖基因所编码的含有167个氨基酸残基的分泌性蛋白质，作为一种特殊的致纤维化因子参与了众多组织增生、肥大及纤维化［1－6］。leptin参与了皮肤创伤修复过程［7－9］，它能刺激成纤维细胞(FB)的增殖和合成胶原。leptin是否在病理性瘢痕这一纤维化疾病的发生方面也起到类似的作用呢?目前国内外学者尚无相关的报道。本实验期望通过检测增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中leptin的表达情况，研究leptin与病理性瘢痕发生的关系，拓展病理性瘢痕在细胞因子致病机理方面的研究，期望为今后的瘢痕防治提供一条新的线索。

1 资料与方法

1.1 临床病例及资料收集

收集川北医学院附属医院烧伤科2010年1月至2010年6月间增生性瘢痕10例，瘢痕疙瘩10例，正常皮肤10例。所有瘢痕标本均取自患者要求进行瘢痕整复手术时所切除的增生性瘢痕，瘢痕疙瘩组织标本，正常皮肤来自包皮环切手术中切除的丢弃的皮肤组织或者植皮手术中供皮区多余的皮肤。所有瘢痕病程均在12～24个月。所有患者均无合并皮肤疾病，结缔组织疾病和其它重要脏器的疾病，未使用类固醇激素，青霉胺和抗肿瘤药物，均未经过化疗，放疗，激光治疗及免疫治疗。标本均经病理证实。每例标本切下后15 min内冰下采集，置入－70℃冰箱保存。

表1 受试者一般临床资料(n=10±s)

表1 受试者一般临床资料(n=10±s)

正常对照组5/5 18±2 －增生性瘢痕组 6/4 25±4 18±5瘢痕疙瘩组3/7 22±7 17±8

1.2 方法

1.2.1 主要仪器和试剂 PCR仪、凝胶成像仪(美国BIO-RAD)、Trzol总 RNA提取试剂盒(美国 Invitrogen公司)，MMLV逆转录酶为Fermentas RevertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(印度Fermenta biotech LTD)，PCR聚合酶(北京天根生化科技有限公司)。

1.2.2 引物设计与合成 根据Genebank中的Leptin基因编码序列(序列号NM_000230.2)，用在线引物设计软件Primer3设计引物，并交上海生工生物工程有限合成。Leptin引物:FP:5'-CGTTAAGGGAAGGAACTCTGG-3'，RP:5'-TTGATGGCTGAAGACCTTGG-3'，产物长度为 250bp。

1.2.3 聚合酶链反应(PCR)Trizol试剂盒提取各组织中的总RNA，测定其浓度和纯度后，各取约1 μg用MMLV逆转录酶逆转录为cDNA备用。定量PCR扩增Leptin，同时扩增GAPDH作内参，反应条件:94℃预变性5 min;94℃变性30 s，51℃退火延伸30 s，以每一标本的平均拷贝数与相应内参平均拷贝数的比值进行统计学分析。

1.3 统计学分析

采用SPSS12.0软件包，组间比较采用单因素方差分析，并进行两两比较，P＜0.05为差异有统有学意义。

2 结果

正常皮肤，增生性瘢痕，瘢痕疙瘩组织中瘦素mRNA的相对表达情况:瘦素mRNA表达在250 bp处出现一条亮带。电泳结果显示10例正常皮肤呈现低表达，表达量为0.55±0.17;增生性瘢痕组织有高表达，表达量为0.86±0.13;瘢痕疙瘩组织呈现超高表达，表达量为 1.32±0.15。Leptin mRNA的表达量在增生性瘢痕组和瘢痕疙瘩组都明显高于正常皮肤组(P＜0.01)，在瘢痕疙瘩组又明显高于增生性瘢痕组(P＜0.01)。(图1，表2)

图1 Leptin PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果

表2 Leptin在各组间表达情况(±s)

表2 Leptin在各组间表达情况(±s)

正常对照组10 0.55 ±0.17增生性瘢痕组 10 0.86 ±0.13*瘢痕疙瘩组 10 1.32 ±0.15*

3 讨论

瘦素(leptin)是由肥胖(ob)基因所编码的含有167个氨基酸残基的分泌性蛋白质，主要由白色脂肪产生，是一种具有多样性功能的活性因子。leptin与器官纤维化的发生关系密切:(1)能够诱血管平滑肌及心肌成纤维细胞的增生肥大［4－5］;(2)Leptin能促肝纤维化的发生、发展，并且是肝纤维化过程中必不可少的因素［1，10－11］;(3)Leptin 也参与肾纤维化发生、发展过程［12－14］;(4)瘦素还能促进矽肺组织纤维化和气道纤维化形成［3，6］;(5)瘦素参与了胰腺纤维化［2］。leptin的致纤维化作用可能主要是通过调节 TGF-β1 等细胞因子的表达而实现［15－17］。学者们［18－20］通过抑制或沉默leptin的表达，能够成功阻抑肝纤维化。Leptin有望成为纤维化疾病基因治疗的新靶点。

Leptin还参与了创伤修复过程，因为研究发现:皮肤创面渗出物中leptin水平增高［7］，并且leptin受体表达上调［8］，受体表达越强则上皮增殖越快［9］，外源性leptin能显著促进创伤愈合［21－22］。成纤维细胞(fibroblast，FB)是主要的创伤修复细胞，FB含所有类型的leptin受体，并且能合成和分泌leptin;外源性leptin能够促进体外培养FB增殖和胶原合成［23］。上述表明，在创伤修复过程，FB能分泌leptin，同时又作为leptin作用的靶细胞之一，介导了leptin促进创面愈合的过程。瘢痕是皮肤组织创伤修复后的必然产物。病理性瘢痕是由于全身和局部因素的影响，发生异常的损伤修复过程，是创伤过度修复的结果。组织学上以成纤维细胞(FB)的过度增生和细胞外基质(ECM)的过度聚集为特征，是一种真皮纤维化疾病。病理性瘢痕包括增生性瘢痕或瘢痕疙瘩。瘢痕疙瘩较增生性瘢痕而言，其胶原合成代谢功能失去正常的约束控制，持续处于亢进状态，以致其胶原纤维增生的程度高于增生性瘢痕。考虑到leptin参与皮肤创面修复过程，结合到leptin能致器官纤维化这一点，我们不禁想到，和致其它器官纤维化一样，leptin在病理性瘢痕这一皮肤创伤过度修复过程中是否也发生了相同的促进作用呢?leptin是否可能也作用于病理性瘢痕的成纤维细胞，导致其过度增殖和细胞外基质的过度沉积?

本研究的结果显示，在病理性瘢痕中存在leptin的高表达，而在瘢痕疙瘩中的表达比在增生性瘢痕中的表达尤高，Leptin的表达程度与瘢痕纤维化程度一致。结果显示leptin参与到了病理性瘢痕的形成过程中。但具体机制需要进一步研究证实。

通过本研究，使瘦素致器官纤维化作用的研究进一步扩展，对病理性瘢痕发病机制中细胞因子方面的研究进一步深入。如果进一步深入研究其致病机理以期进行药物干预，这也为延缓病理性瘢痕发生的进程提供了一条新的思路，为病理性瘢痕的治疗提供新的理论支持，这将可能为病理性瘢痕患者带来新的希望。

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