电针“神庭、百会”穴对脑缺血再灌注损伤大鼠认知功能的影响

张 蕴，吴羽楠，李钻芳，林如辉，陶 静，陈立典

(1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040;2.福建中医药大学，福建 福州350122)

脑卒中是危害中老年人身体健康的主要疾病之一，目前的发病率达120 ～180/10 万，患病率达400 ～700/10 万。脑卒中后所带来的各种功能障碍也严重的影响了患者的生活质量和生命质量，其中认知功能障碍较为常见［1］，大约26%的卒中患者会导致严重的认知障碍［2］。在临床治疗方面，目前主要以改善脑循环、营养脑细胞并配合康复训练等手段为主，治疗周期长，疗效也不明显［3，4］，而电针对卒中后认知功能障碍的治疗具有大量的临床经验和稳定的临床疗效，但是缺乏具体的作用机制的研究。本研究观察针刺经验效穴“神庭”、“百会”两穴对模型大鼠脑组织抵抗缺血损害的作用，并进一步观察该方法对大鼠认知功能的改善情况。

1 实验材料与方法

1.1 实验动物

由福建中医药大学实验动物中心提供，许可证为SYXK2012-003，共60 只成年的雄性清洁级SD 大鼠，适应性喂养1 周，自由饮食和饮水，其湿度控制在50% ～70%之间，恒温22℃，其光照为早8:00 ～晚20:00，体重平均在(270 ±20)g。

1.2 主要仪器、器械及试剂

仪器:①手术仪器:剪刀、弯镊、显微镊、显微剪、动脉血管夹、止血钳、持针器(唐山先锋医疗器械有限公司);②Morris 水迷宫(中国医学科学院药物研究所);③伦牌SDZ-II 电针仪、0.5 寸华佗牌不锈钢毫针(北京瑞康众成科技有限公司)。

试剂:10%水合氯醛，碘伏，酒精。

1.3 动物模型的制备

在SPF 级实验室进行，大鼠称重后，按照3 ml/kg的剂量，用10%的水合氯醛进行麻醉，四肢和头部固定，然后将颈部正中的皮肤消毒、备皮、剪开，将颈总动脉彻底暴露，沿着颈总动脉向上分离颈内动脉和颈外动脉的主干及分支，结扎颈内、颈外动脉分叉处，血管夹夹住颈内动脉分叉处，然后结扎颈总动脉远端，并在离结扎1 ～2 mm 处剪一小口，将线拴插入颈内动脉，松开血管夹，其插入的深度大约距颈内、外动脉的分叉处18 ～22 mm，最后固定线栓，手术完成后将其放在木屑中并温水保温，密切观察其变化，2 h 后将线栓缓慢退出。假手术组仅将动脉分离，然后缝合。

大鼠醒后，参照Longa 法，通过神经行为学的评分，判断造模的情况，将不符合要求的予以剔除。制得模型组、假手术组、电针组各20 只。

1.4 干预措施

假手术组和模型组:不予任何治疗。给予同等条件的喂养。

电针组:参照大鼠穴位定位参考《实验针灸学》［5］，选取神庭、百会穴进行针刺，采用疏密波，频率1 ～20 Hz，每次30 min，1 次/日，疗程为1 周。

1.5 检测方法与观察指标

1.5.1 神经行为学测试 采用Longa 法对大鼠神经行为学进行测试，从造模后第1 天开始，直至第7 天处死，以观察大鼠运动功能的变化。造模后2 h 拔完鱼线，直接进行神经行为学的评分，参照Longa 法:①0分，无神经缺失的症状;②1 分，不能完全伸展对侧前爪;③2 分，向右侧侧转圈;④3 分，向对侧倾倒;⑤4分，神经缺失症状严重，不能行走。其中，0 分、4 分判断为造模未成功，并予以剔除，从造模后第1 天开始，1次/日，进行神经行为学的评分(注:每日电针完后进行)，直至大鼠处死。

1.5.2 脑梗死体积观测 采用TTC 染色后观察大鼠脑梗死体积的变化。TTC 染色:①按照3 ml/kg 的剂量，用10%的水合氯醛进行麻醉;②充分暴露心脏后用生理盐水进行灌注，直至眼睛发白;③断头取脑，要求速度快并且保持大脑的完整性;④放在专门的脑槽置于-20°冰箱中速冻15 min;⑤切片:第一刀在脑前极与视交叉连线中点处，每隔2 mm 切1 片，共切6片;⑥将切片放入2%TTC 染液中，用锡箔纸盖住避光，然后放在恒温37°的水浴锅中15 min，注意要不时翻动脑片，使之染色均匀［6］。

1.5.3 水迷宫实验应用 利用水迷宫对大鼠进行定位航行实验、空间探索实验观察大鼠行为学、记忆功能变化。

Morris 水迷宫实验:为了防止大鼠伤口感染，各组大鼠均从造模后第2 天进行测试，每次于电针干预完后进行。水迷宫为一个圆形的水池，直径120 cm，高度50 cm，主要包括定位航行实验和空间探索实验，实验时将其水温控制在24 ～28℃之间，水深定在30 cm，水池壁上有4 个等距离点，将其划分4 个象限。平台搁置在以上任意象限的中央即可，该平台的直径为5 cm，高度28 cm，，距离水面2 cm 即可，水池周边的光线不宜太亮，不要放置明显的参照物［7］。

①定位航行实验(place navigation):通过大鼠逃避潜伏期，判断其学习记忆的能力，所谓逃避潜伏期是指大鼠在90 s 内找到平台，并在平台上能停留3 s，如果90 s 内没有完成，则逃避潜伏期的时间按照90 s 计算，然后将其放置平台10 s，让其熟悉，通过此方式每天进行2 次训练，持续5 天。每次训练时将其从4 个不同的象限依次放入，每个象限的入睡点固定，间隔5 min，然后计算4 个象限平均潜伏期及平均路程。

②空间探索实验(spatial probe):通过大鼠穿越平台区域的次数，判断其空间记忆的能力，即在定位航行实验后的第6 天上午，将平台撤掉，然后把大鼠放入任意入水点，计算90 s 内大鼠经过平台区的次数。

1.5.4 跳台实验 利用跳台仪的反应箱对大鼠进行跳台实验观察大鼠行为学、记忆功能变化。跳台实验在造模后第7 天电针干预完之后，将各组大鼠放入跳台仪的反应箱内的铜栅处，使其适应3 min，然后接通电源，如果大鼠四肢同时接触铜栅，此时会遭受电击(2 s，0.5 mA)，大鼠会反射性的向安全平台区上跳跃，而当大鼠跳下平台后会继续遭受电击，计算大鼠在3 min内遭受的电击次数，以此作为判断大鼠被动学习的能力。该实验进行完之后将其放回笼中，24 h 之后再将大鼠放置在安全平台上，测量3 min 内大鼠从平台安全区跳下的时间，作为大鼠记忆的能力。

1.6 统计学分析

采用SPSS17.0 分析软件，统计描述采用频数、均数、标准差，统计推断计数资料3 组之间总体差异的比较采用单因素方差分析，组间均数两两比较方差齐时采用LSD 法，方差不齐采用Dunnelt＇s T3 法，P ＜0.05表示统计学具有差异。

2 结果

2.1 大鼠神经行为学评分

表1 电针对动物神经行为学评分的影响

从表1 可以看出，结果显示模型大鼠的神经行为学得分处于较高水平，提示神经功能缺陷较为严重，而电针组的大鼠行为学得分逐步降低，显示经过电针治疗后，大鼠的神经功能缺失逐渐恢复，部分功能重建改善，使得分降低。

2.2 TTC 染色后观察大鼠脑梗死体积的变化

从图1 及表2 结果中可以看到，在电针治疗后，大鼠的脑细胞梗死体积正在逐步缩小，相对于模型组，差别有统计学意义。

表2 电针对大鼠脑梗死体积的影响(%)

图1 大鼠脑梗死体积变化

2.3 定位航行试验大鼠经过路程和逃避潜伏期的比较

表3 结果提示:模型组大鼠所经过的路程显著长于假手术组，而经过治疗后，电针组到达目标所需要路程明显减少，差别有统计学意义(P ＜0.05)。

注:与假手术组比较，aP ＜0.05;与模型组比较，bP ＜0.05。

表4 各组大鼠每天逃避潜伏期的比较(单位:s)

2.4 空间探索实验大鼠穿越平台区域的次数

表4 结果提示:模型组大鼠逃避潜伏期显著长于假手术组，而经过治疗后，电针组耗时小于模型组，差别有统计学意义(P ＜0.05)。

表5 大鼠穿过位置的平台的次数

2.5 跳台试验中大鼠电击次数与跳下平台的时间

表5 结果显示在造模后第7 天，撤去平台，测大鼠在90 s 内穿过平台所在位置的次数，电针组穿过平台位置的次数明显多于模型组，差异具有统计学意义(P ＜0.05)。

表6 跳台试验中电针对大鼠学习和记忆的影响

表6 显示术后第7 天电针结束后进行跳台实验，实验幵始前大鼠放入反应笼中适应3 min，实验结果表现为电针组大鼠遭受电击次数明显少于模型组(P ＜0.05)。24 h 后测大鼠从平台安全区跳下时间，与模型组相比，电针组大鼠跳下平台的平均潜伏期明显延长(P ＜0.05)。

从以上实验可以看出，模型大鼠在经过电针干预后，脑梗死的体积逐步缩小，行为能力和记忆能力都在改善，与模型组相比，各项指标的差别均有显著性变化(P ＜0.05)。

3 讨论

本实验研究用MCAO 模型大鼠，观察电针神庭、百会对卒中后认知功能障碍大鼠行为学的影响，其中通过神经行为学的评分，判断模型成功与否，其标准是将评分2 分(向右侧转圈)或者3 分(向对侧倾倒)的MCAO 大鼠纳入研究对象，不符合的予以剔除，针刺治疗后，笔者发现造模后前3 天，电针组与模型组相比，P ＞0.05，无统计学差异，而电针组、模型组与假手术组相比，P ＜0.05，说明模型是比较成功的，而从造模后第4 天，电针组与模型组相比，P ＜0.05，具有统计学意义，说明电针组使大鼠的神经行为学评分降低。

在TTC 染色中，由于TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)是脂溶性光敏感复合物，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内由于脱氢酶活性下降［8］，因此会呈现苍白色，利用这一实验技术的原理，可以形象直观的看见电针是否可以减轻梗死面积，最后经过统计分析，可以看见电针组的梗死面积与模型组相比，P ＜0.05，提示电针神庭、百会可以降低MCAO大鼠的梗死面积，同时，从以上实验图片也可以看出MCAO 的模型还是比较成功的。

在与认知相关的水迷宫实验中，从大鼠定位航行和空间探索的实验数据，可以看见模型组、电针组在游泳路程、平均潜伏期上与假手术组相比都明显的延长，说明MCAO 模型的确是影响了大鼠的认知功能，而电针组在游泳路程、平均潜伏期上与模型组相比又有所缩短，并且P ＜0.05，说明电针的确可以增强卒中后认知功能障碍大鼠的学习和记忆能力，而在大鼠的跳台实验中，从大鼠遭受的电击次数和跳下平台的时间也相应的得到了验证，说明电针神庭、百会可以改善MCAO 后大鼠的学习记忆能力。

［1］ Jose AS，Roma GC. Citicoline in Vascular Cognitive Impairment and Vascular Dementia After Stroke［J］.Stroke，2011，25:40-43

［2］ ROMANGC. Vascular dementia- Advances in nosology，diagnosis，treatment and prevention［J］.Paruninerva Med，2004，46:207-15

［3］ Pinkston JB，Alekseeva N.Toledo EG Stroke and dementia［J］.Neurological Research，2009，31:824-831

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［5］ 邓春雷.实验针灸学［M］.北京:人民卫生出版社，1998:7

［6］ 王相斌，宋福聪，郭鹏，等. 卒中后认知功能障碍与神经元特异性烯醇化酶相关性研究［J］.河北医药，2010，24(11):45-46

［7］ 许二赫，武剑，贾建平.血管性痴呆患者血浆中Aβ 及Tau 蛋白的检测分析［J］.中风与神经疾病杂志，2012，25(5):102-103

［8］ 傅建明，顾旭东，姚云海，等. 头皮针长时间留针法结合康复训练对脑卒中认知障碍患者生存质量的影响［J］. 中华中医药学刊，2012，9(4):80-81