针刺百会透悬厘对脑出血模型大鼠脑组织IL-6 蛋白表达的影响*

李雪岩，黄 亮，刘 刚，尹洪娜△，孙忠人

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨150001;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨150040)

脑部出血后，脑血肿会很快形成，由于血肿的不断刺激，引起出血点周围压力增加，导致细胞出现代谢障碍。更多的实验表明:在脑出血的初步阶段，血管通透性增强，进而引起脑细胞水肿。为了解决这一难题，导师在临床中用本法治疗脑出血患者，收到较好疗效，针刺可以激活受伤的脑细胞，促进神经细胞进一步的分化自救，并且针刺具有促进脑内大部分血肿吸收、减轻脑水肿的相关作用［1］。IL-6 作为一种促炎症介质，伴随出血参与发病的全过程。因此本研究通过观察分析百会透悬厘针刺法对脑出血急性期模型大鼠脑组织中白细胞介素-6 表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物

Wistar 大鼠(健康、清洁级、雄性)80 只，每只(280 ±10)g。

1.2 设备

①数码相机Japan;②自动脱水机XGQ-15/20 泰州世纪康峰机电制造有限公司;③微量注射器;④生物组织包埋机KH-BL，湖北孝感阔海医疗科技有限公司;⑤307-6 型台式牙钻机，中国上海齿科医械厂;⑥石蜡切片机LEICA RM 2135，中国天津航空机电公司;⑦电热恒温箱;⑧展片机TEC-2601 型 常州市郝思琳医用仪器有限公司;⑨烤片机PPTHK-21B，上海精密仪器仪表有限公司;○10恒温低温冰箱;○1电子天平FA1004N，郑州时代仪器设备有限公司;○12病理图像分析系统JD801，江苏省捷达科技发展有限公司;○13Motic image 3.2 图像分析软件，Motic 公司生产○14立体定位仪ZH-蓝星B 型，中国安徽仪器厂。

1.3 试剂

①PV-6001 二步法免疫组化检测试剂，北京中杉金桥生物有限;②IL-6 免疫组化试剂盒，武汉博士德生物有限公司;③DAB 显色试剂盒，天津百浩生物科技有限公司;④多聚赖氨酸，广州市一科生物有限公司;⑤Na2HPO4·12H2O，分析纯，北京康普汇维科技有限公司;⑥多聚甲醛，分析纯，北京康普汇维科技有限公司;⑦NaCl，分析纯，广州市一科生物有限公司;⑧NaH2PO4·2H2O，分析纯 北京康普汇维科技有限公司。

1.4 实验动物分组

将80 只大鼠，随机取8 只为A 组，剩余72 只造模成功后，随机分为B 组、C 组、D 组各24 只，分为2 天、7 天、14 天时间段，每段8 只大鼠。C 组与D 组于造模成功6 h 后，给予相应的药物与针刺治疗，然后在对应的2 天、7 天、14 天时间段停止治疗，先给予神经功能学评分，之后取材。

A 组(对照组):不做手术处理，断头取材。

B 组(模型组):造模后2 天、7 天、14 天分别先给予神经功能学评分，然后取材。

C 组(西药组):造模成功6 h 后，给予脑活素稀释液灌胃(按人:大鼠体重为200∶1 配置)。2 天组连续灌胃2 天，1 ml tidpo;7 天、14 天同上，于各时间点后先给予神经功能学评分，然后取材。

D 组(针刺组):造模成功6 h 后，针刺病灶侧百会穴透悬厘穴，取穴方法参照华兴邦等制定的《实验动物穴位图谱》，留针30 min，期间捻转1 次，时长控制在1 min，频率为200 转/min。针刺治疗2 天、7 天、14 天后，先给予神经功能学评分，然后取材。

1.5 脑出血模型的制备

首先确定尾壳核位置。采用脑内靶向注射胶原酶诱发大鼠ICH 模型。定点定位后，用牙科钻钻直径为1.0 mm 的圆孔，深达硬脑膜表面，将微量注射器固定于立体定位仪上，沿钻孔垂直进针约6 mm，用自动推进器按每只0.8 U(0.1 U/μL)胶原酶Ⅶ，以1 μL/min的速度缓慢匀速注入右侧尾状核，缓慢出针。缝合头皮，局部皮肤采用碘酚消毒，防止局部感染影响指标观察。

1.6 标本取材

麻醉，暴露心脏，左心室插管，抵达升主动脉根部，于右心耳剪0.2 cm 口做出口。将9%氯化钠200 ml灌注，等到流出的变清澈，换100 ml 的4%多聚甲醛灌注，等到标本变硬。断头取脑，切片、固定、脱水、浸蜡、包埋制成石蜡切片，用于相关检测。

1.7 行为学的观察

成功造模后，做好保温，即于2 天、7 天、14 天评价神经功能缺损，根据Berderson 神经功能体征评分方法:带好防护手套，提起鼠的尾巴悬至高于桌面20 ～25 cm 位置，记录前肢病后体位。正常大鼠双侧前肢向下伸直，无神经功能缺损-0 分;脑病灶对侧前肢肩部、腕部、肘部屈曲并内收-1 分;1 分体征+推大鼠向瘫痪侧时阻力下降-2 分;2 分体征+自发性旋转-3 分。

1.8 HE 染色

石蜡切片;脱蜡相关水化;经过苏木精后，流水冲;分化后，流水冲;返兰后，水洗并浸泡;染色，脱水，经透明，后封片。

1.9 IL-6 免疫组织化学检测

①切片脱蜡;②放在30%H202 溶液中孵育8 min，PBS 洗5 min3 次;③热抗原修复;④滴加血清封闭液;⑤滴加一抗;⑥滴加化二抗工作液;⑦DAB 显色;⑧苏木素复染，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观测。

1.10 IL-6 蛋白表达

胞浆内呈现棕黄色小颗粒，细胞核有部分着色。

1.11 统计学处理

采用SPSS17.0 软件进行统计。计量数据以均数±标准差(±s)表示。各实验组间的两两比较采用t检验，以P ＜0.05 为有显著差异，以P ＜0.01 为有极显著差异。

2 结果

2.1 神经功能缺损评分比较

针刺和西药治疗均能减少神经功能缺损评分。造模后3 个时间点，D 组与B 组比较有显著性差异(P ＜0.01)，D 组与C 组比较有明显差异(P ＜0.05)。见表1。

表1 各组大鼠神经功能学评分(±s)

表1 各组大鼠神经功能学评分(±s)

注:与B 组比较，* P ＜0.05，△P ＜0.01;与C 组比较，●P ＜0.05。

组别 n 造模后2 天 7 天 14 天B 组造模前24 0 1.51±0.49 2.66±0.45 2.34±0.46 C 组 24 0 1.34±0.47 2.16±0.69 1.65±0.46*D 组 24 0 1.15±0.37 1.34±0.46△● 1.18±0.38△

2.2 脑组织IL-6 阳性细胞平均灰度值比较

大鼠脑组织中IL-6 检测的阳性细胞平均灰度值，在造模后3 个时间点，D 组与B 组比较有显著性差异(P ＜0. 01)，D 组和C 组两者结果有差异(P ＜0.05)。见表2。

表2 各组大鼠IL-6 阳性细胞平均灰度值比较(±s)

表2 各组大鼠IL-6 阳性细胞平均灰度值比较(±s)

注:与A 组比较，＊P ＜0.05;与B 组比较，* P ＜0.05，△P ＜0.01;与C 组比较，●P ＜0.05。

组别 n 2 天 7 天 14天8 166.50±4.29 166.50±4.29 166.50±4.29 B 组 24 179.57±8.34＊ 178.21±5.78＊ 174.51±3.62＊C 组 24 179.68±2.95 177.86±7.01 171.52±3.71*D 组 24 171.85±4.93 170.21±3.51△● 163.83±4.41 A 组△●

3 讨论

近年来，针灸治疗脑出血的研究从临床应用向基础研究发展，通过不同视角、不同的研究手段，揭示针刺治疗脑出血的作用机理。广大学者充分运用现代理化等不同的方式方法，通过动物实验模型复制等不同方面对头穴针刺治疗中风的作用机理予以深入的研究探讨。在前人研究的基础上，笔者再次进一步的研究了脑出血与运动功能及脑水肿与炎性因子的变化关系，以提供更好的临床治疗方法为更多的病患解决病痛。

脑出血后细胞因子表达主要包括NF-κB、IL-6、TNF-α、IL-8 和IL-1 等。IL-6 是一种调节炎症和参与免疫反应有关的重要细胞成员，它主要由内皮cell、成纤维cell、T-cell、单核巨噬cell、B-cell 等在外因作用下产生的糖蛋白，那么IL-6 被认为是促炎症介质之一，对多种细胞都有一定的影响，其生物学活性也较广泛，特别是在脑出血后IL-6 能够调节炎症反应中的中性粒细胞功能，直接参与脑损伤。并与多种因子有协同或加强的作用，比如TNF 和IL-1 等。

在脑内，IL-6 由多种细胞分泌比如神经元细胞、血管内皮细、神经胶质细胞，而其中主要来源为神经胶质细胞，其主要作用是调控炎症反应，从而起到营养和保护神经细胞的作用。另外IL-1 是一种致炎因子，而IL-6 能够抑制其合成，从而使神经元损伤减轻，这也就说明IL-6 能起到抗炎和抑制免疫反应的多方面作用。所以，通过实验IL-6 水平表达增高，表明其参与了脑出血后的细胞损伤或修复。

周爽等［2］研究表明检测到IL-6 过度表达时，说明神经元细胞此时已有损伤，脑出血后释放各种炎症介质，过多的IL-6 刺激细胞表达白细胞粘附分子，使白细胞向损伤区浸润，与此同时损伤区TNF、IL- α、IL-8 合成，形成出血后损伤［3］。另一方面部分分子的粘附性增强，进而导致微血管的阻塞，这样补体系统被激活，产生毒性细胞，破坏现有的细胞成分。这一事实会导致链式反应，使病损灶周围血管收缩功能、通透性下降而引起脑水肿。而水肿带的形成，又会向外扩张，压迫周围的及邻近的脑组织，产生对应的功能区的损伤。

神经功能缺损的量化评定与血清中IL-6 浓度的关系是正相关的，为研究提供了很好的理论依据。刘丹等［4］研究进一步证明这一观点，并再次指出血清中IL-6 表达与出血量的多少、缺损的神经功能程度表现为正相对应关系，可以更进一步解释为:出血多IL-6表达高，出血少IL-6 表达低;则功能缺损重，其血清中IL-6 表达水平高于运动功能缺损程度轻的。同样脑水肿程度越严重，其血清中IL-6 浓度相对也高，所以根据血清中IL-6 的表达水平可以推测其预后情况。

李丽［5］、于洋［6］通过实验也证明血清中IL-6 的动态变化:出血量越多，其预后效果相对较差，而出血量越少，其预后效果相对较好。肖家平［7］提供药物早期干预治疗后，减轻了脑水肿的程度，降低了血清中IL-6 的表达，同时清除了自由基，保护了脑细胞。周汝娟等［8］通过相关实验表明:当血清中检测出IL-6过高表达时，其脑水肿程度较重，而引起血管再次出血的可能性也较大。吴涛［9］同样也通过实验证明在脑出血早期，血清中的IL-6 是成上升状态的，随着药物的治疗，血清中的IL-6 浓度控制在一定水平，然后逐渐下降，进而控制了感染，降低了脑水肿，改善了脑功能。现在IL-6 的测定不仅在基础实验中，而且也已应用于临床。研究已表明:IL-6 参与脑血管疾病恢复过程，为预后判断提供了重要依据。

导师在临床用本法治疗脑出血患者众多，同时也收到了较好的治疗效果，故通过这次基础实验研究来进一步提供理论依据支持。本实验说明“百会透悬厘”针刺法可以:①减轻神经功能缺损程度;②保护急性期脑出血中受损的细胞。针刺治疗中风病历史悠久，在临床实践中效果突出。脑出血后通过少针透刺治疗是未来的趋势，更是研究的方向，希望更多的专家、学者加入进来，为本疗法提供更多的临床和基础研究依据。

［1］ 石学敏.中风病与醒脑开窍针刺法［M］.天津:天津科学技术出版社，1998:323-325

［2］ 周爽，方邦江，黄建华.电针对高血压性脑出血大鼠海马GiZ、Gi3基因转录的影响［J］.中国中医基础医学杂志，2005，11(6):437-439

［3］ 纪晓军，何对，温兆霞，等. 头穴针刺对大鼠急性期脑出血血脑屏障影响的实验研究［J］.中国急救医学，2001，21(11):624

［4］ 刘丹，杨巧莲，张红宇，等.急性脑出血患者血清IL-6 和TGF-β1 含量变化及临床意义［J］. 卒中与神经疾病，2004，6(11):156-158

［5］ 李丽.急性脑出血患者血清TNF-ɑ、IL-6、No 的动态监测及临床意义［J］.中国医师杂志，2003，5(12):1711-1712

［6］ 于洋.脑出血患者出血量与脑脊液中白介素-6 的关系［J］.中国现代医生，2009，47(9):20-21

［7］ 肖家平.依达拉奉对脑出血患者血清白介素-6 和基质金属蛋白酶-9 水平的影响及疗效分析［J］.中国当代医药，2010，17(17):29-31

［8］ 周汝娟，何龙锦，杨峰.血清白介素-6 和肿瘤坏死因子-α 与脑出血早期再出血的关系［J］.蚌埠医学院学报，2010，35(11):28-29

［9］ 吴涛.脑出血患者使用醒脑静注射液后血浆白介素-6 和肿瘤坏死因子-α 浓度的变化研究［J］. 药物与临床，2012，9(15):23-24