片仔癀对局灶性脑梗死大鼠BDNF 和IL6蛋白表达的影响

孟 佳,黄希艳,李 倩,朱陵群

片仔癀对局灶性脑梗死大鼠BDNF 和IL6蛋白表达的影响

孟 佳1,2,黄希艳2,李 倩2,朱陵群2

目的观察片仔癀对局灶性脑梗死大鼠模型脑源性神经营养因子(BDNF)和白细胞介素-6(IL-6)蛋白表达的影响。方法采用改良的Longa法制备大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,SD大鼠随机分为7组:假手术组、模型组、脑得生组、尼莫地平组及片仔癀大、中、小剂量组。通过免疫组化方法检测脑组织BDNF和IL-6的蛋白表达,HE染色观察脑组织的病理损伤情况。结果在梗死中心区,模型组的BDNF和IL-6蛋白表达显著低于假手术组(P<0.01),片仔癀各剂量组的BDNF和IL-6蛋白表达均高于模型组(P<0.05或P<0.01);在梗死周围区,模型组BDNF和IL-6蛋白表达均较假手术组显著升高,片仔癀各剂量组BDNF的蛋白表达均高于模型组(P<0.01),而IL-6蛋白表达均低于模型组(P<0.05)。片仔癀大、中剂量组的脑组织病理形态较模型组有明显改善。结论片仔癀可以上调局灶性脑梗死后大鼠BDNF的蛋白表达水平和下调IL-6蛋白表达,减轻脑缺血导致的神经功能损伤。

脑梗死;片仔癀;大脑中动脉栓塞;脑源性神经营养因子

脑血管病是目前发病率、致残率和病死率均较高的严重疾病之一,缺血性脑血管病在脑血管病的发病中占60%～80%[1-3]。因此很有必要探讨其发病机制及药物保护问题。片仔癀由三七、天然麝香、天然牛黄、蛇胆等天然药材组成,具有清热解毒、凉血化瘀、消肿止痛的显著功效[3,4]。我们前期的研究表明,片仔癀对脑梗死的缺血性神经损伤具有保护作用[1,2],但在脑梗死后对脑源性神经营养因子(BDNF)和白细胞介素-6(IL-6)作用的相关研究较少。本研究为了进一步研究片仔癀对脑梗死后的脑保护作用,探讨其恢复机制,建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)大鼠模型,并给予片仔癀进行干预,观察BDNF和IL-6变化,为临床治疗提供理论及实践基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物与药物 SPF级SD雄性大鼠,体重260 g±20 g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,许可证编号:SCXK(京)2006-0009。片仔癀胶囊(漳州片仔癀药业股份有限公司提供,批号: 0711050);脑得生购自广东国医堂制药股份有限公司(批号:110101);尼莫地平片购自拜耳医药保健有限公司(批号:113275);兔抗大鼠BDNF和IL-6抗体购自武汉博士德生物有限公司和北京博奥森生物技术有限公司(批号:BA0565、bs-0782R);尼龙栓线购自北京沙东生物技术有限公司(型号2636),线身直径0.26 mm,栓头直径0.36 mm±0.02 mm,线身长40 mm。

1.2 MCAO模型制备 按照已报道的改良Longa方法[3,4]制备模型:SD大鼠随机分为手术组和非手术组(假手术组),术前禁食12 h,腹腔注射3.5%水合氯醛麻醉(1 mL/100 g),颈正中切开皮肤,钝性分离肌群后暴露右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉,结扎颈外动脉及颈总动脉的近心端,在颈总动脉远心端剪一小口,将尼龙线栓从此小口插入颈内动脉,感觉阻力时立即停止进线,插入18 mm～22 mm,固定栓线和缝合皮肤。假手术组只行颈部正中切开和缝合。大鼠清醒后参照Longa方法对其神经功能进行评分[3,4]。

1.3 动物分组及给药方法 给药剂量按大鼠与人的体表面积等效剂量折算,手术组根据术后Longa评分将纳入大鼠随机分为模型组,片仔癀大、中、小剂量组(486 mg/kg、162 mg/kg、54 mg/kg),脑得生组(486 mg/kg),尼莫地平组(10.8 mg/kg)。造模前3 d开始给药,造模后第7天取材。假手术组和模型组分别灌胃给予等体积的生理盐水,各组均每日给药1次,药物现用现配。

1.4 取材及样品制备 神经功能评分后,各组大鼠3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉,迅速断头取脑,冰上视交叉后2 mm处取大鼠脑组织置于10%的甲醛溶液中固定24 h,常规梯度酒精脱水、浸蜡包埋,冠状连续切片。部分切片常规HE染色,部分切片用于免疫组化染色。

1.5 免疫组织化学染色 石蜡切片常规脱蜡至水, PBS(0.01 mol/L,pH 7.4)冲洗5 min;0.01 mol/L枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中微波热修复20 min;冷却至室温后PBS冲洗3 min×3次;3%过氧化氢避光室温放置15 min;磷酸缓冲液(PBS)冲洗3 min×6次;滴加一抗BDNF或IL-6(1∶100),4℃冰箱过夜;恢复室温后PBS冲洗3 min×3次;滴加HRP标记的羊抗兔二抗后37℃孵育30 min;PBS冲洗3 min×3次;加DAB避光显色,冲水终止;常规梯度乙醇和二甲苯脱水、透明,中性树胶封片。用PBS替代一抗为阴性对照。

1.6 图像分析 将已免疫染色的切片置于OLYMPUS BX60型显微镜下观察,免疫阳性反应为棕黄色颗粒。分别于脑梗死的中心区、周边区、对侧正常区随机选取5个视野,SPOT-Ⅱ系统采集图像,Meta Morph图像分析软件分析BDNF和IL-6阳性信号的光密度值。

1.7 统计学处理 采用SPSS 16.0统计软件包分析。所得数据经正态分布及方差齐性检验后用均数±标准差(±s)表示,组间两两比较采用t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 病理学改变 模型组可见较大范围伴大小不等空泡的坏死区,软化灶明显,部分残存神经元出现核固缩深染,核溶解或核仁消失,细胞界限模糊,水肿明显,坏死灶的周围区可见较多的嗜中性粒细胞;假手术组的脑组织形态结构和神经元结构均正常。与模型组相比,片仔癀大、中剂量组的坏死区明显减小,周围的神经元的胞核和核仁清楚可见,水肿明显减轻,部分大鼠的神经元结构接近正常;脑得生组和尼莫地平组的坏死区范围、水肿较模型组明显减小或减轻,坏死区周围的部分神经元结构接近正常。

2.2 片仔癀对BDNF蛋白表达的影响 梗死中心区:模型组的BDNF蛋白表达显著低于假手术组(P< 0.01),片仔癀大剂量组、脑得生组和尼莫地平组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。梗死周围区:模型组的BDNF蛋白表达明显高于较假手术组(P<0.05),片仔癀大剂量组、片仔癀中剂量组、尼莫地平组与模型组比较,差异有统计学意义(P<0.01);片仔癀大剂量组的BDNF蛋白表达明显高于小剂量组(P<0.05)。梗死对侧正常区:模型组的BDNF蛋白表达高于假手术组,各药物组的BDNF蛋白表达高于模型组,但差异无统计学意义。详见表1。

表1 片仔癀对BDNF蛋白表达的影响(±s)OD值

表1 片仔癀对BDNF蛋白表达的影响(±s)OD值

组别_____________________________n 梗死中心区梗死周围区梗死对侧正常区______假手术组80.113±0.0060.113±0.0060.113±0.006模型组80.053±0.0072)0.138±0.0051)0.131±0.007片仔癀小剂量组80.059±0.0080.162±0.0120.134±0.010片仔癀中剂量组80.065±0.0090.173±0.0104)0.128±0.011片仔癀大剂量组80.091±0.0104)0.188±0.0174)5)0.147±0.011尼莫地平组80.101±0.0084)0.201±0.0174)0.154±0.014 _脑得生组_____________________________8______________________________________________________________________________________________ _____________0.074±0.0113)0.162±0.0130.139±0.008 _____与假手术组比较,1)P<0.05,2)P<0.01;与模型组比较,3)P<0.05,4)P<0.01;与片仔癀小剂量组比较,5)P<____________________ 0.05。

2.3 片仔癀对IL-6蛋白表达的影响 梗死中心区:模型组IL-6蛋白表达显著低于假手术组(P<0.01),尼莫地平组、脑得生组及片仔癀大剂量组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。梗死周边区:模型组较假手术组显著升高(P<0.01),片仔癀大剂量组、脑得生组、尼莫地平组与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。梗死对侧正常区:模型组IL-6蛋白表达较正常组升高,各用药组均低于模型组,尼莫地平组表达最低,其次为脑得生组及片仔癀大、中、小剂量组,但差异无统计学意义(P<0.05)。详见表2。

表2 片仔癀对IL-6蛋白表达的影响(±s)OD值

表2 片仔癀对IL-6蛋白表达的影响(±s)OD值

组别____________________________n 梗死中心区梗死周围区梗死对侧正常区______假手术组80.126±0.0110.126±0.0110.126±0.011模型组80.043±0.0152)0.233±0.0162)0.144±0.017片仔癀小剂量组80.059±0.0080.201±0.0190.142±0.010片仔癀中剂量组80.062±0.0130.208±0.0110.140±0.011片仔癀大剂量组80.083±0.0164)0.181±0.0133)0.138±0.008尼莫地平组80.114±0.0104)0.178±0.0153)0.125±0.011 _脑得生组80.081±0.0114)0.183±0.0153)_______________________________________________________ 0.131±0.012 _____与假手术组比较,1)P<0.05,2)P<0.01;与模型组比较,3)P<0.05,4)P<______________________________________________________ 0.01。

3 讨 论

BDNF属于神经营养素家族,主要分布在中枢神经系统的各个部位[5]。国内外的大量研究表明,脑缺血性损伤后,其神经元的损伤程度与BDNF的表达水平密切相关,BDNF的高表达能够明显增强神经元抗缺血性损伤的能力,BDNF在维持神经元功能、缺血性损伤后的再生修复和防止神经元退行性改变等方面发挥着至关重要的作用[5,6]。IL-6主要表达于神经元和小胶质细胞,IL-6在脑组织损伤过程中发挥着双重作用[7,8],BDNF和炎症因子间存在相互作用[9],一些研究发现,BDNF对IL-6的表达具有调节作用,BDNF等神经营养因子可减轻受损脊髓的炎症反应,并减少神经组织IL-6的分泌,保护损伤的神经细胞[10,11]。

本实验研究发现,片仔癀大、中剂量能够明显减少坏死区的范围,使脑组织水肿明显减轻,神经功能障碍有不同程度的改善,神经功能评分显著好于模型组,提示片仔癀大、中剂量对脑梗死所致的神经元等脑组织缺血性损伤有很好的保护作用。研究还发现,在脑梗死中心区模型组的BDNF和IL-6的蛋白表达均较假手术组显著降低,片仔癀各剂量组BDNF和IL-6的蛋白表达均高于模型组,但均低于假手术组,这可能是脑梗死中心区的脑组织缺血水肿、变性坏死严重,神经元大量缺血坏死、神经纤维溶解等病理损伤,导致各种蛋白质和神经递质合成减少所致,而片仔癀能够不同程度地上调脑梗死中心区BDNF和IL-6的蛋白表达水平,促进神经元等脑组织缺血性损伤的修复或再生。在梗死周边区,模型组BDNF和IL-6蛋白表达均较假手术组显著升高,片仔癀可显著上调BDNF蛋白的表达和下调IL-6蛋白的表达,提示BDNF蛋白的高表达和IL-6蛋白的低表达可能有利于缺血性损伤的神经元对缺血性损伤的耐受,片仔癀对缺血性神经元的功能保护及恢复有重要作用,片仔癀可以促进神经元的功能恢复及再生。而在梗死对侧正常区,模型组BDNF和IL-6蛋白表达均较假手术组高,各药物组的BDNF蛋白表达高于模型组,而IL-6蛋白表达低于模型组,但差异无统计学意义,提示该区域的神经元等脑组织可能参与了脑梗死后缺血性损伤的神经元功能的恢复与再生,其可能的机制有待进一步观察和研究。

[1]Liu L,Zhu L,Zou Y,et al.Panax notoginseng saponins promotes stroke recovery by influencing expression of Nogo-A, NgR and p75NGF,in vitro and in vivo[J].Biol Pharm Bull,2014, 37(4):560-568.

[2]Kim G,Kim E.The effects of antecedent exercise on motor function recovery and brain-derived neurotrophic factor expression after focal cerebral ischemia in rats[J].J Phys Ther Sci,2013,25 (5):553-556.

[3]黄希艳,李倩,朱陵群.片仔癀对脑梗死大鼠ZO-1、MMP-9蛋白及mRNA表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2013, 11(3):342-343.

[4]李倩,黄希艳,朱陵群.片仔癀对局灶性脑梗死大鼠水通道蛋白4 (AQP4)表达的影响[J].中西医结合心脑血管病杂志,2013,11 (1):59-61.

[5]Berretta A,Tzeng YC,Clarkson AN.Post-stroke recovery:The role of activity-dependent release of brain-derived neurotrophic factor[J].Expert Rev Neurother,2014,14(11):1335-1344.

[6]Takeshima Y,Nakamura M,Miyake H,et al.Neuroprotection with intraventricular brain-derived neurotrophic factor in rat venous occlusion model[J].Neurosurgery,2011,68(5):1334-1341.

[7]穆艳云,沈梅红,程洁,等.电针对脑缺血再灌注模型大鼠海IL-6表达影响的观察[J].辽宁中医杂志,2013,40(4):797-799.

[8]Suzuki S,Tanaka K,Suzuki N.Ambivalent aspects of interleukin-6 in cerebral ischemia:Inflammatory versus neurotrophic aspects [J].J Cereb Blood Flow Metab,2009,29(3):464-479.

[9]杨芸,荣荣,但齐琴,等.BDNF抗体封闭对大鼠脑缺血损伤肺组织IL-6表达的影响[J].四川大学学报(医学版),2012,43(6): 922-925.

[10]Lu P,Jones LL,Tuszynski MH.BDNF-expressing marrow stromal cells support extensive axonal growth at sites of spinal cord injury[J].Exp Neurol,2005,191(2):344-360.

[11]邓凤君,杨迎暴,徐江平,等.表没食子儿茶素没食子酸酯对脊髓损伤大鼠炎症因子释放及神经营养因子表达的影响[J].中国实验方剂学杂志,2010,16(5):195-198.

Effects of Pien Tze Huang on the Expression of BDNF and IL-6 Protein in Rats with Focal Cerebral Infarction

Meng Jia,Huang Xiyan,Li Qian,Zhu Lingqun
The First Clinical Medical College,Key Laboratory of Chinese Internal Medicine of Ministry of Education and Beijing,Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China Corresponding Author:Zhu Lingqun

ObjectiveTo observe the effect of Pien Tze Huang(PTH)on expression of brain-derived neurotrophic factor(BDNF) and interleukin 6(IL-6)protein in rats with focal cerebral infarction model.MethodsThe middle cerebral artery occlusion(MCAO) was established by the modified Longa method.Sprague-Dawley(SD)rats were randomly divided into sham operation group,model group,high,medium and low dose PTH group,Naodesheng(NDS)group and nimodipine group.Pathological damage were observed by HE staining.ResultsIn the central area of infarction,the expression of BDNF and IL-6 protein in model group were significantly lower than that in sham operation group.The expression of BDNF and IL-6 protein in Pien Tze Huang group were higher than those in the model group.In the area around the infarction,expression of BDNF and IL-6 protein in model group were significantly higher than those in the sham operation group,BDNF protein expression in PTH group were higher than those in the model group while the expression of IL-6 protein was lower than that in model group.Compared with model group,high and medium dose PTH groups had significant improvement on pathologial changes in brain tissue.ConclusionPTH can up-regulated expression of BDNF protein and down-regulation expression of IL-6 protein after focal cerebral infarction,alleviate nerve function injury caused by cerebral ischemia.

cerebral infarction;Pien Tze Huang;middle cerebral artery occlusion;brain-derived neurotrophic factor

R743 R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.017

1672-1349(2015)06-0754-04

2015-02-10)

(本文编辑郭怀印)

国家“重大新药创制”科技重大专项课题(No.2008ZX09202)

1.北京中医药大学第一临床医学院(北京100700);2.北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部重点实验室和北京市重点实验室

朱陵群,E-mail:lingqunzh@vip.sina.com