桑杞清眩颗粒干预自发性高血压大鼠心肌细胞凋亡的实验研究

李 琳,冯 润,黄 力

·基础医学论著/研究·

桑杞清眩颗粒干预自发性高血压大鼠心肌细胞凋亡的实验研究

李 琳,冯 润,黄 力

目的观察桑杞清眩颗粒对高血压心肌重构的抑制作用及其可能机制。方法选8只4周龄雄性WKY大鼠和16只4周龄雄性自发性高血压(SHR)大鼠,WKY大鼠作为对照组(WKY),SHR大鼠随机分为模型组(SHR组)和给药组(SQ+SHR组),每组8只。每组在治疗16周后处死大鼠,尾套法测量SHR尾动脉收缩压、舒张压、平均压,计算心脏重量指数;用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)染色来检测凋亡心肌细胞;用蛋白免疫印迹法检测大鼠心肌组织中B淋巴细胞瘤-2(Bc l-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化型半胱天冬酶-3(cleavedCaspas e-3)。结果与WKY组相比,桑杞清眩颗粒显著抑制SHR大鼠收缩压的升高、心脏重量指数的增加、抑制高血压引起的大鼠心肌细胞凋亡、Bcl-2的降低及Bax和cleaved Caspas e-3的增加。结论桑杞清眩颗粒可以抑制SHR大鼠血压升高,减轻心肌肥厚,其作用机制可能与抑制自发性高血压大鼠心肌细胞凋亡有关。

自发性高血压;桑杞清眩颗粒;心肌细胞凋亡

中国疾病预防控制中心(CDC)慢性非传染性疾病预防控制中心近期公布的一项横断面研究显示,2010年中国成年人中高血压患病率高达33.5%,估计患病人数达3.3亿,45万人死于高血压[1]。长期高血压造成的左心室重塑是发生各种心血管并发症的独立危险因素,与心肌梗死、心力衰竭、恶性心律失常、心源性猝死等密切相关。心肌重塑的典型特征是心肌细胞的肥大和凋亡,间质纤维化和炎性改变[2]。桑杞清眩颗粒是一种中药复方,临床用于治疗高血压病,主要由桑寄生、枸杞子、杜仲、决明子、野菊花、丹参、葛根、泽泻等药物组成。我们前期的研究证实,桑杞清眩颗粒具有干预心室重构和减轻心肌炎症的抗炎作用[3,4]。本研究旨在观察桑杞清眩颗粒的降压作用是否与干预心肌细胞凋亡机制有关。

1 材料与方法

1.1 动物 16只4周龄雄性自发性高血压(SHR)大鼠购于北京维通利华技术有限公司,8只4周龄雄性WKY大鼠购于上海莱斯利实验动物中心。动物饲养在安静的房间,恒定的温度(20℃～22℃)和湿度(50%～60%)与12 h光暗周期。

1.2 分组及给药方法 SHR大鼠随机分为模型组(SHR组)、给药组(SHR+SQ组),每组8只。WKY组作为对照组,WKY组和SHR组每日予蒸馏水2 mL/100 g,SHR+SQ组给予桑杞清眩颗粒每日2 mL/100 g,分2次间隔8 h灌胃,疗程共16周。

1.3 药品与仪器

1.3.1 药品 桑杞清眩颗粒由桑寄生、枸杞子、杜仲、决明子、野菊花、丹参、葛根、泽泻组成,由卫生部中日友好医院药学部制剂室制备(批号20090801),取桑杞清眩颗粒40 g,加蒸馏水100 mL充分混匀,配成混悬液,相当于每毫升含饮片1.24 g。

1.3.2 仪器及试剂 BP-98A智能无创血压计(日本Softron公司),AB204-S精密天平(瑞士梅特勒索-托利多),yp2001N电子秤(上海清海仪器有限公司), CP64精密电子秤(SARTORIUS),TD25-WS多管架自动平衡离心机(湘仪离心机),多功能酶标仪(美国伯乐公司),-80℃冰箱(美国Thermo)。细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)Elisa试剂盒购于美国R&D公司。过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)α、PPARγ、核转录因子(NF-κB)Western-blot试剂盒,购于美国Abcam公司。

1.4 检测指标及方法

1.4.1 血压检测 每隔2周测血压1次,每次测3遍,取其平均值,记录在案。分别在给药前、给药后1周～16周每2周相同时间各测血压1次。采用智能无创性尾套式大鼠血压计,测量清醒安静状态下SHR尾动脉收缩压(SBP)、舒张压以及平均压。测量之前加热鼠尾10 min达37℃。

1.4.2 心脏重量指数 治疗后16周,大鼠取完整心脏,4℃冷生理盐水冲洗,滤纸吸干水分,电子天平称重。计算心脏重量(HW)/体重(BW)比值(mg/g),评价左室肥厚程度。

1.4.3 用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL) 染色法来检测凋亡心肌细胞;石蜡切片脱蜡至水,实验选用原位凋亡检测试剂盒(Roche Basel,Switzerland),按试剂盒说明进行操作,用激光扫描共聚焦显微镜系统(Axiovert 200M,Carl Zeiss, Jena,Germany),在63倍物镜下,进行观察和拍照,其中细胞核染成蓝色,而TUNEL阳性的细胞核为绿色。1.4.4 蛋白免疫印迹法检测 蛋白免疫印迹法检测大鼠心肌组织中B 淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated x protein,Bax)、活化型半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3)的蛋白表达。从组织中提取蛋白,经过蛋白定量,SDS-PAGE电泳,转膜,免疫反应,显影,定影,最后凝胶图像分析,得到最后结果。

1.5 统计学处理 采用SPSS软件进行统计分析。所得数据以均数±标准差(±s)表示,采用方差分析,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠SBP的影响 治疗8周、16周后,SHR组收缩压逐渐升高,明显高于WKY组和SHR+SQ组,治疗后SHR+SQ组血压较SHR组明显降低(P<0.05)。详见表1。

表1 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠SBP的影响(±s)mmHg

表1 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠SBP的影响(±s)mmHg

组别____n治疗前治疗后8周治疗后16周WKY组 8113.80±7.46116.60±10.38117.80±6.57 SHR组 8122.20±11.05176.80±9.831)184.20±6.721)SHR+SQ组8125.60±10.29152.40±8.912)155.40±4.562)______与WKY组比较,1)P<0.05;与SHR组比较,2)P__________ <0.05。

2.2 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠心脏重量指数的影响

治疗后,SHR+SQ组心脏重量指数比SHR组明显降低(P<0.05)。详见表2。

表2 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠心脏重量指数的影响(±s)

表2 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠心脏重量指数的影响(±s)

组别____nBW(g)HW(mg)HW/BW(mg/g) WKY组 8677.90±79.70 1 831.00±266.98 2.71±0.37 SHR组 8383.33±11.96 1 705.00±107.474.45±0.281)SHR+SQ组8384.50±33.34 1 477.00±173.433.86±0.501)2)______与WKY组比较,1)P<0.05;与SHR组比较,2)P__________ <0.05。

2.3 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠心肌细胞凋亡的影响(见表3、图1) 桑杞清眩颗粒能够显著性地抑制长期高血压引起的大鼠心肌组织中TUNEL阳性细胞数的增多。WKY大鼠心肌组织内没有观察到TUNEL阳性细胞。SHR组大鼠心肌组织内可以观察到数量较多的TUNEL阳性细胞,提示大鼠的部分心肌细胞发生凋亡。给药组大鼠心肌组织内TUNEL阳性细胞数量明显减少。

表3 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠心肌细胞凋亡的影响(±s)

表3 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠心肌细胞凋亡的影响(±s)

组别_________________n 心肌细胞凋亡_________ WKY组80.00±0.00 SHR组820.40±2.881)_SHR+SQ组89.80±1.792)_____与WKY组比较,1)P<0.05;与SHR组比较,2)P<_______ 0.05。

图1 各组大鼠心肌组织内TUNEL阳性细胞计数的

2.4 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠心肌组织中Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-3蛋白表达水平的影响 与WKY组相比,SHR组大鼠心肌中抑制凋亡的蛋白Bcl-2显著降低,促细胞凋亡的蛋白Bax显著性地升高,桑杞清眩颗粒可以显著性地抑制Bax/Bcl-2的比值升高。与WKY组相比,SHR组大鼠心肌中的cleavedCaspase-3表达的升高,桑杞清眩颗粒可以抑制高血压引起的心肌组织中cleaved Caspase-3表达的升高。详见表4、图2、图3。

表4 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠心肌组织中凋亡相关蛋白的影响(±s)

表4 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠心肌组织中凋亡相关蛋白的影响(±s)

_组别n Bax/Bcl-2(%)_cleaved Caspase-3(%) WKY组81.42±0.81 0.56±0.22 SHR组84.45±1.571)1.26±0.381)_SHR+SQ组81.66±1.222)0.77±0.232)_____与WKY组比较,1)P<0.05;与SHR组比较,2)P<________ 0.05。

图2 SHR大鼠心肌组织中凋亡相关蛋白Western Blot分析

图3 桑杞清眩颗粒对SHR大鼠心肌组织中凋亡相关蛋白的影响

3 讨 论

长期高血压可引起靶器官的功能损害,心为主要受累之脏,西医主要表现为左心室肥厚(LVH),其组织病理学改变是左心室重构,最终可致心力衰竭。中医则进而发展为“喘证”“心悸”“水肿”之证。肝肾阴阳失调是贯穿高血压—左心室重构—心力衰竭疾病进展过程中关键的病理变化,其基本病机为本虚标实。本虚以肾阴亏虚为主,标实以肝阳上亢、瘀血阻滞、痰浊壅滞多见。针对上述病因病机,故在治疗上,采用补肝益肾、平肝潜阳、活血化瘀之法。应用桑寄生、决明子、丹参、葛根等药物,以调整阴阳失衡。诸药合用虽重在补益肝肾、平肝潜阳、活血化瘀,同时又用丹参入心经,养血益阴,使心肾两脏相互交通,水火相济,阴阳协调,从而达到相生互化,标本同治之功。桑杞清眩颗粒(原名降压脉净液)已在临床应用多年,其降压效果及预防靶器官损害作用已得到临床验证[5],并获批为院内制剂。本研究应用该方作用于自发性高血压大鼠,旨在探讨其降压作用是否与干预心肌细胞凋亡机制有关。

研究显示自发性高血压大鼠在代偿期心肌重构过程中就存在有心肌细胞凋亡现象;而在病程进展到左心扩大,心功能减退时,心肌细胞凋亡程度进一步加重[2,6,7]。表明凋亡在心脏代偿性肥厚到心力衰竭的转折过程中起着重要的作用。长期心室后负荷增加除引起心肌细胞肥大外,还触发Bax蛋白表达上调,Bax/ Bcl-2比值增加,从而导致心肌细胞凋亡。Bcl-2原癌基因是一种主要存在于线粒体膜及核膜的蛋白质,与细胞凋亡呈负相关,Bcl-2高表达可抑制凋亡。目前发现Bcl-2家族成员有十几个之多,可分为促凋亡因子及抑凋亡因子。Bcl-2为凋亡抑制因子;而另一个家族成员Bax则为促凋亡因子,其过度表达将诱导细胞凋亡。当长期高血压时,Bcl-2/Bax的比值决定着细胞是存活或是走向凋亡[6]。

本研究用TUNEL染色的方法来检测凋亡, TUNEL染色的方法已在心肌组织广泛应用于标记凋亡细胞。Bcl-2基因是细胞凋亡的潜在抑制因子, Bax和cleaved Caspase-3等是促细胞凋亡的蛋白。本研究显示桑杞清眩颗粒可以使SHR心肌组织内TUNEL阳性细胞数量明显减少。桑杞清眩颗粒可以显著性地抑制Bax/Bcl-2的比值升高,抑制SHR心肌组织中cleaved Caspase-3表达的升高。提示其降压及干预左室重构的作用可能和抑制心肌细胞凋亡有关。进一步可对凋亡相关通路信号深入研究,探讨其上游及下游的相关因子,具体阐明其抑制心肌细胞凋亡的机制。

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Effects of Sangqi Qingxuan Granule on Cardiomyocyte Apoptosis in Spontaneously Hypertensive Rats

Li Lin,Feng Run,Huang Li
China-Japan Friendship Hospital,Beijing 100029,China Corresponding Author:Huang Li

ObjectiveTo observe the inhibitory effects of Sangqi Qingxuan granule(SQG)on hypertensive myocardial remodeling,and investigate its possible mechanism.MethodsEight only 4 weeks of male WKY rats and 16 only 4 weeks male spontaneously hypertensive rats(SHR)were selected.WKY rats as the control group,SHR were randomly divided into model group and SQG treatment group,each group of eight.Rats were executed after the treatment of 16 weeks.The tail artery systolic pressure,diastolic blood pressure,average pressure were measured by tail set method.The cardiac weight index was observed.The myocardial cells apoptosis was detected by DNA nucleotides terminal transferase mediated Nick end labeling method(TUNEL)staining method.The B lymphocyte tumor-2(Bc l-2),Bc l-2 associated protein X(Bax),activated caspase 3(cleaved caspas e-3)in myocardial tissue were detected by protein immunoblot method.ResultsCompared with WKY group,the levels of systolic blood pressure,heart weight index,myocardial cell apoptosis,Bax and cleave d-caspase 3 were decreased while the level of Bc l-2 was increased in SQG treatment group.ConclusionSQG can inhibit the blood pressure,reduce the myocardial hypertrophy in SHR.Its mechanism may be related to inhib-i ting myocardial apoptosis in SHR.

spontaneously hypertensive rats;Sangqi Qingxuan granule;cardiomyocyte apoptosis

R541.1R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2015.06.013

1672-1349(2015)06-0743-03

2015-02-04)

(本文编辑郭怀印)

国家自然科学基金专项基金项目(No.81041039)

中日友好医院(北京100029)

黄力,E-mail:lihstrong@163.com