天麻素脂质体的制备及其结构表征

覃引，邱树毅，张振，周剑丽，胡女丹

(1.贵州理工学院 制药工程学院，贵州 贵阳 550003；2.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025)



天麻素脂质体的制备及其结构表征

覃引1，邱树毅2，张振1，周剑丽1，胡女丹1

(1.贵州理工学院 制药工程学院，贵州 贵阳 550003；2.贵州省发酵工程与生物制药重点实验室，贵州 贵阳 550025)

目的 研究天麻素脂质体的最佳制备工艺，并表征其结构。方法 采用薄膜—超声法制备。以包封率为指标，卵磷脂与胆固醇之间的质量比、油水相的体积比和超声时间为考察因素，采用L9(34)正交试验法优化制备工艺；显微镜下观察脂质体的形态、粒径大小和分布，并测定其包封率和稳定性。结果 回归方程式为Y=239.75X+0.0207(n=5),R2=0.9996，在0.002～0.010 mg/mL范围内具有良好的线性关系。最佳工艺为：卵磷脂与胆固醇的质量比为4:1、水油相的体积比为3:1、超声时间控制为60 min；脂质体呈现类球形或椭圆形，形态规则、大小均匀；平均包封率为60.65%，平均粒径分布为327 nm，稳定性良好。结论 优选后的制备工艺稳定，所需设备简单，包封率较高，粒径较均匀，可适用于包埋水溶性药物。

天麻素；脂质体；包封率；制备工艺；正交试验

天麻GastrodiaelataBl.为兰科植物天麻的干燥块茎，是我国名贵的中药材之一，天麻素(gastrodine)是其主要成分[1]。现代药理学研究表明天麻素具有增加中央及外周动脉血管顺应性,降低外周血管阻力,增加心脑血管血流量,产生温和降压作用,而且对心肌细胞、脑组织均有保护作用,同时具有镇静、催眠、镇痛、增强免疫等作用，临床上广泛用于治疗心脑血管、微循环系统疾病，疗效显著，且无明显不良反应[2]。目前常用制剂有天麻素注射液、天麻素片、天麻素胶囊。但一般口服剂型的生物利用度不高，采用脂质体当做药物载体能有效提升患者胃肠道吸收能力，改善原本药物的释放性质[3]。本研究将天麻素制成天麻素脂质体，对其制备工艺进行了研究，确定了最佳配方，并测其包封率、稳定性、粒度、形状等质量指标，旨在提高疗效，为天麻素的新剂型开发和临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 天麻素对照品(购自中国药品生物制品检定所，批号：110807)；天麻(购自贵州省药材公司)；大豆卵磷脂(购自北京双旋微生物培养基制品厂，批号：041129)； 胆固醇(购自海蓝季科技发展有限公司，批号：051120)；磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH6.8)，严格按照2010年版《中国药典》相关标准进行配制；其他试剂均为分析纯。

1.3 方法

1.3.1 脂质体的制备：采用薄膜—超声法制备脂质体，称取大豆相应剂量的卵磷脂和胆固醇，按照一定的比例倒入三角瓶容器内并加入15 mL氯仿溶解，氯仿经过蒸发后，瓶壁内形成一层脂膜，对脂膜给予干燥、去除氯仿味操作，加入15 mL的乙醚进行溶解处理，并在恒温振荡器加入 5 mL PBS溶液振荡至均匀状态，随后使用超声仪器制成乳(W/O型)，静置0.5 h，使用旋转蒸发仪去除乳液有机溶剂，此时容器内壁出现凝胶，依次实施蒸发处理使得凝胶脱落，添加50 mL PBS溶液，获取脂质体的混悬液，冰放入冰箱内存储。

1.3.2 脂质体包封率的测定

① 绘制标准曲线：精密称定在80 ℃环境下干燥至恒重状态的10 mg天麻素标准品，置于100 mL的容量瓶并甲醇稀释并定容至刻度，轻轻混匀，得0.1 mg/mL的天麻素贮备液。分别吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL贮备液，置于10 mL容量瓶内，用甲醇定容形成梯度溶液，以甲醇作为对照，于220 nm处分别测量其吸光度。

② 精密度试验：选取0.006 mg/mL天麻素对照品溶液，以甲醇作为对照，于220 nm处测量其吸光度(n=5)。

③专属性试验分别选用空白、破乳脂质体和天麻素标准品在同一环境下利用光谱进行扫描。

④ 脂质体的包封率：采用移液枪吸取合理剂量的脂质体混悬液添加至1.5 mL塑料离心管内，利用离心机进行10 min的冷冻离心操作，同时吸取清液0.5 mL放入50 mL容器内，采用PBS溶液进行稀释至刻度，在220 nm处测量其吸光度，采用外标法算得游离药物量W游。按下式计算包封率：

包封率(En)%=(W总-W游))/ W游×100%

1.3.3 正交试验优化脂质体制备工艺：根据预实验得出的结论可以看出，卵磷脂与胆固醇之间的质量比(A)、油水相的体积比(B)和超声时间(C)等方面均会影响脂质体的形成及变化。本次实验通过质量比(A)、体积比(B)、超声时间(C)3项指标进行研究，运用正交实验方法，各个因素分别抽取3个水平，采用不同因素的包封率(En %)作为评价指标，运用L9(34)正交表统计分析，获得包封天麻素最佳工艺组合。因素水平表见表1。

第三，要完善农业用水计量设施。目前我们的计量设施不完善，仅占1/3左右。目前水费的收取有两种形式，一种是按方计算，有计量设施的，比如1 m3水交多少钱。最明显的是井灌区，都是搞IC卡，农民付了多少水费，插进去就灌多长时间，这种方法的收取是百分之百，而且科学合理。但是非井灌区很多都是按亩收费，一亩地核定多少稻谷、核定多少玉米，折算成货币来收取，实际用了多少水也不清楚，所以下一步要加大量水设施的建设。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels table

1.3.4 验证试验：根据优化的工艺组合制备3批天麻素脂质体，根据“1.3.2”项下④计算获得包封率。

1.3.5 观察脂质体形态并测量粒径

① 把制备完成的脂质体混悬液进行多倍的稀释，吸取一定的液体滴入载玻片，盖好盖玻片，放在显微镜下认真观察并拍照。

② 通过负染法把脂质体进行稀释操作，给予1 %磷钨酸实施染色，放入铜网上进行制样，借助透射电镜认真观察并拍照。

③ 脂质体采用水当做分散介质，通过激光粒度分析仪测量其粒径分布情况及其平均大小。

1.3.6 稳定性试验

① 计算脂质体的渗透率

测定制备当日脂质体的包封率，随之将脂质体放入冰箱内 4 ℃ 存储。分别在10、20、30、40、50 d时测量脂质体的包封率，渗透率公式为：

渗透率(Pe)% =(当日所测包封率-定期测量包封率)/当日测得的包封率×100%。

② 粒径变化

按“①”项下的方法处理样品，再按“1.3.5”项下的③方法测量脂质体平均粒径变化情况。

2 结果

2.1 标准曲线的绘制 以吸光度为纵坐标(Y),浓度为横坐标(X)，绘制天麻素标准曲线，回归方程式为：Y=239.75X+0.0207,R2=0.9996(n=5)。由计算结果可知，在0.002～0.010 mg/mL范围内具有良好的线性关系。见图1。

图1 天麻素的标准曲线Fig.1 Standard curve of gastrodine

2.2 精密度试验结果 获取该脂质体的吸光度值RSD为0.41%,表明本试验所用仪器具有良好的精密度。

2.3 专属性试验结果 天麻素标准溶液、天麻素脂质体和空白脂质体，3者在相同波长处，吸光度无干扰，表明方法的专属性较强。见图2。

图2 标准样品(a)、天麻素脂质体(b)和空白脂质体(c)的紫外图谱Fig.2 Ultraviolet spectrum of standard sample (a)，gastrodine liposome (b) and black liposome(c)

2.4 正交试验优化最佳工艺参数 各因素对脂质体包封率的影响大小次序为C > B > A，最佳配方为C3B2A3，即：卵磷脂与胆固醇的质量比为4:1、水油相的体积比为3:1、超声时间控制为60 min。正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 正交试验L9(34)结果Tab.2 Results of L9(34)orthogonal experiment design

表3 方差分析表Tab 3 Analysis of orthogonal experiment design variance

F0.05(2，2)=19.00，F0.01(2，2)=99.00

2.5 验证试验 3批天麻素脂质体平均包封率是60.65%，计算的RSD为2.31 %。验证试验结果表明按照最佳制备配方完成的各批脂质体之间的包封率更为接近，重现性良好，表明使用的制备和测量方法可行性高。

2.6 天麻素脂质体的形态

2.6.1 脂质体的显微形态：制备的脂质体呈现类球形或椭圆形，形态规则，脂质体大小均匀，见图3，图4。

图3 显微镜下天麻素脂质体的形态(×400)A:染色脂质体；B：未染色脂质体Fig.3 Morphology of gastrodine liposome under microscope (×400)A:dyed liposome;B:un-dyed liposome

图4 电镜下的天麻素脂质体形态(×400)Fig.4 Microscope of gastrodine liposome under transmission electron microscope(×400)

2.6.2 测定脂质体粒径大小及分布情况：天麻素脂质体的平均粒径为327 nm， 粒径分布见图5， 图5表明脂质体粒径分布处于均匀状态。

图5 脂质体的粒径分布Fig.5 Particle diameters distribution of liposmes

2.7 渗透率测定结果 任意选择制备完成的脂质体样品(7号样品) 按照“1.3.3”项下③的方法对其渗透率进行计算，见表6，由此可知，脂质体放置50 d后再次计算其渗透率为0.687%，RSD为1.89%。认真观察脂质体外观情况，脂质体随着贮存时间的增加，粒径大小并无明显变化，并未发现明显的团聚和沉淀情况，见图4。pH值也并未改变。表示该脂质体具有缓释的效果并具有良好的稳定性，能够长期贮存。

3 讨论

本研究借助薄膜-超声法对天麻素脂质体进行制备，这种制备方法操作比较简单，粒径分布良好，成为制备脂质体的主要方法之一。正交试验的方差分析结果表明所选因素对包封率的测定无显著影响，因此不需要再进行多重比较分析，原因可能因实验存在误差且自由度比较小(仅为2)，导致试验的灵敏度下降，在一定程度上掩盖考察因素的显著性[4]。

对于包封率的测定，本文采用了“高速离心+UV检测”的方法，结果表明精密度良好，可信度高。除此之外，包封率的测定还有“透析”[5]、“电泳”[6]、“凝胶层析”[7]、超滤[8]等方法，但相比本文采用的方法，操作较繁琐，耗时长。多种因素会影响脂质体的包封率[9-11]，除去制备所用工艺外，选用物质的分子量、pH值等都会对其有一定的影响，但上述因素还有待深入研究。

对天麻素脂质体进行制备的过程中，加入相应剂量的卵磷脂能出现双分子层的作用，添加胆固醇能促使脂质体形成双层膜，降低膜流动情况及其渗透率[12-13]。通过分析其因素可知，添加的胆固醇剂量并非越大效果越好，如果加入大量的胆固醇可能导致其与脂膜发生反应，促使脂膜间的药物与磷脂的功能有所减弱，一定程度上可以降低脂质体的包封率，通过本试验结果得出卵磷脂与胆固醇比值为2:1时，脂质体的效果最好。

[1] 岑信力.天麻的化学成分与药理作用研究进展[J].中药材，2005，28(10) ：958-962.

[2] 于颖，樊光辉.天麻素的临床应用研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志，2012，10(9)：1117-1118.

[3] 齐宪荣，魏树理.脂质体作为药物输送系统的应用[J]).中国要学杂志，1999，34(3)：145-147.

[4] 崔福德主编.药剂学[M].第5版.北京： 人民卫生出版社，2003，389-390.

[5] 郑庆忠，刘利军.pH梯度法制备氧化苦参碱脂质体[J].中国医药工业杂志，2006，37(10)： 679-681.

[6] 魏铭，刘小平，李惠，等.苦参碱脂质体的研究[J].武汉理工大学学报，2006，28(8)： 46-50.

[7] 苗彩云，邓树海，陈江飞.氧化苦参碱负电荷脂质体的制备及理化性质研究[J].中国药学杂志，2006，41(8)：1400-1404.

[8] 雷国峰，陈琳，邓英杰，等.超滤法-HPLC法测定灯盏花素脂质体的包封率[J].沈阳药科大学学报，2006，23(4)：237-240.

[9] 牟琳琳，徐洋，蒋宫平，等.改良 pH 梯度法制备盐酸小檗碱脂质体[J].中国新药杂志，2013，48(1)：49-53.

[10] 李文静，杨志强，王杏林.两种硫酸长春新碱脂质体包封率测定方法的比较[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(14)：71-75.

[11] 陈蓓，袁明奎，王建华，等.葡聚糖凝胶柱色谱法测定阿苯达唑纳米脂质体包封率的方法研究[J].中国药房，2012，23(45)： 4281-4284.

[12] 曾诚，黄伟，何承辉，等.复合磷脂脂质体的研究进展[J].国际药学研究杂志，2015，42(1)：91-95.

[13] 苏鹏权，赵莉，徐宝财，等.表面活性剂的性能与应用(V)——脂质体及其应用[J].日用化学工业，2014，44(5)：252-256.

(编校：王冬梅)

Preparation and structure characterization of gastrodine liposomes

QIN Yin1, QIU Shu-yi2, ZHANG Zhen1, ZHOU Jian-li1, HU Nv-dan1

(1.School of Pharmaceutical Engineering, Guizhou Institute of Technology, Guiyang 550003, China; 2.Guizhou Province Key Laboratory of Fermentation Engineering and Bio-pharmacy, Guiyang 550003, China)

ObjectiveTo study the optimum preparation process of gastrodin liposome, characterization its structure.MethodsPerpared gastrodin liposome with film-ultrasonic method.The entrapment efficiency as index, quality between lecithin and cholesterol ratio, oil-water phase volume ratio and ultrasonic time as factors by L9(34) orthogonal test to optimize the preparation process.Observed the liposome morphology, particle size and distribution under the microscope, and determined the entrapment efficiency and stability.ResultsRegression equation wasY=239.75+0.0207X(n=5),R2=0.9996, 0.002 to 0.010 mg/mL had a good linear relationship.The optimum of preparation process: lecithin and cholesterol quality ratio was 4:1, water and oil phase volume ratio of 3:1, ultrasonic time control for 60 min; Liposomes showed spherical or oval shape, regular shape, uniform size.The average entrapment efficiency was 60.65%, the average particle size distribution at 327 nm, and it had good stability.ConclusionThe preparation of gastrodine liposome has advantages of simple, higher entrapment efficiency and even particle size.The method can be used for embedded water-soluble medicine.

gastrodine; liposome; entrapment efficiency; preparation process; orthogonal test

贵州理工学院科研基金(XJ2K20131204)

覃 引，女，硕士，讲师，研究方向：药物制剂，E-mail：qinyin0510@126.com。

R282.71

A

1005-1678(2015)05-0029-04