富硒化对博落回有效成分抑菌效果的影响研究

王珂佳，刘芸，任艳玲Δ

(1.贵州轻工职业技术学院，贵州 贵阳 550002；2.贵州铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300)



富硒化对博落回有效成分抑菌效果的影响研究

王珂佳1，刘芸2，任艳玲1Δ

(1.贵州轻工职业技术学院，贵州 贵阳 550002；2.贵州铜仁职业技术学院，贵州 铜仁 554300)

目的 研究富硒化对博落回姚效成分抑菌效果的影响。方法 以青霉素钠、生理盐水为对照，采用琼脂扩散纸片法检测各富硒化博落回组处理9种常见细菌的平均抑菌圈直径；以20%甲醇、生理盐水作为对照，用20%的甲醇将平均抑菌圈最小的富硒化博落回组，无硒处理博落回组和青霉素钠组分别稀释，使浓度均为0.48、0.24、0.12、0.06、0.03 mg/mL，采用琼脂平板稀释法测定其MIC，评价对其9种常见细菌的抑制作用。结果 富硒化处理能大幅提高博落回生物碱的抑菌效果，100 μg/mL亚硒酸钠处理组的平均抑菌圈最小(15.33 mm)；富硒化博落回生物碱对大肠杆菌O1、大肠杆菌P22、都伯林大肠杆菌的最低抑菌浓度为从原来0.96 mg/mL降低至0.24 mg/mL；对鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌的最低抑菌浓度为0.12 mg/mL；对金黄色葡萄球菌、猪链球菌的最低抑菌浓度为0.06 mg/mL；对枯草芽孢杆菌和李氏杆菌的最低抑菌浓度小于0.03 mg/mL。结论 富硒化显著改善博落回的抑菌效果，为今后富硒博落回的开发利用，奠定了理论基础。

富硒化；博落回；血根碱；抑菌效果

博落回MacleayaCordata(wild) R.Br.为罂粟科博落回属多年生草本植物，别名三钱三，又名筒杆、滚地龙等，在贵州又称马耳杆，黄薄荷[1]。博落回中主要含有血根碱(sanguinarine)、白屈菜红碱(chelerythrine)、黄连碱(coptisine)、小檗碱(berberine)、博落回碱(boccon-line)、α-别隐品碱(α-allocryptopine)、β-别隐品碱(β-allocryptopine)等异喹啉衍生物类生物碱[2]，其在抗菌消炎、清热解毒、增强免疫力、抗肿瘤等方面具有显著作用[3]。赵东亮等[4]研究证明盐酸血根碱具有很强的广谱抑菌作用。王朝元等[5]研究发现博落回总生物碱抗菌作用较强，对金黄色葡萄球菌的抑制作用尤为显著。此外，杨军等[6]药理研究表明，博落回对四氯化碳所致慢性肝损伤有显著疗效。硒元素为人体必需的微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化酶(GSH-PX)的重要成分，硒元素在消除体内多种有害自由基,增强机体免疫力，抗细胞衰老，抗氧化，抗癌等方面都有突出的作用，硒缺乏会导致克山病、大骨节病等地方性疾病[7-8]。目前，随着对硒元素生理作用研究的不断深入，证明了硒元素与人体健康关系密切。我国传统的中草药，在补硒方面具有明显的优势。经过富硒处理的中草药，治病同时可以补硒，且无机硒经中药植株吸收转化为有机硒后，可以降低毒性，提高血硒含量[9]。本文选择抗菌效果作为考察指标[4-5]，比较富硒化博落回提取液和无硒处理博落回提取液对9种常见细菌的抑制效果，研究富硒化对博落回有效成分抑菌效果的影响，为富硒博落回的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种 供试菌种共9种，由贵州大学药理实验室提供。分别为大肠杆菌P22(EscherichiacoliP22，E.coliP22)，猪霍乱杆菌(Baclilluscholeraesuis,B.choleraesuis)，猪链球菌(Streptococcussuis，S.suis)，大肠杆菌O1(EscherichiacoliO1，E.coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，S.aureus)，李氏杆菌(Listeriamurrayi，L.murrayi)，鼠伤寒杆菌(Salmonellatyphimurium，S.typhimurium)，都伯林大肠杆菌(EscherichiaDublin，E.Dublin)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis，B.subtilis)。

1.2 药品与试剂 博落回采自产地贵州省施秉县，经贵州大学生命科学学院罗应春副教授鉴定为罂粟科植物博落回MadeayaCordate(Wild)R.Br。牛肉膏(购自北京双旋微生物培养基制品厂)；蛋白胨(购自北京双旋微生物培养基制品厂)；琼脂粉(购自上海蓝季科技发展有限公司)；注射用青霉素钠(800万单位，购自华北制药有限公司)。氯化钠(购自天津市大茂试剂厂)；盐酸，氢氧化钠(购自重庆川江试剂厂)；亚硒酸钠(购自成都市科龙试剂厂)。

1.3 供试培养基 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基：用于细菌培养。主要成分蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂粉8 g，蒸馏水1000 mL， pH 7.0～7.5。

1.4 方法

1.4.1 博落回富硒化处理：采用分根繁殖手段移栽15株博落回植株，设置0、60、80、100、120 μg/mL Na2SeO35个实验组[10-11]，每组均含3株博落回植株。待幼苗成活并长至20 cm时，分别用对应浓度的亚硒酸钠溶液进行叶面喷施，每月1次，共3次。待博落回果实成熟后，采样晒干，粉碎成细粉过60目筛备用。

1.4.2 药物制备：按王珂佳等[12]方法提取富硒化处理各组博落回生物碱，提取液用20 %甲醇定容，使提取液中血根碱浓度为0.5 g/mL。冷藏备用。

1.4.3 药品配制：将经富硒化博落回生物碱提取液(血根碱浓度0.5 g/mL)，用20%甲醇配制成血根碱含量分别为0.96 mg/mL和4.8 mg/mL的溶液，备用。

1.4.4 菌悬液的制备：用接种环在斜面上先划一条直线，再蘸取已活化菌种在斜面上划Z字性斜线，避免菌种间污染，置37 ℃恒温培养箱中培养。24 h后，观察培养情况并选取生长情况良好的菌种，用含0.1 %吐温80生理盐水将菌种洗出，倒入灭菌培养皿中，用血球计数板调整菌液浓度至105～106个/mL。

1.4.5 抑菌试验：① 定性试验：采用琼脂扩散纸片法[4]进行富硒化博落回生物碱抑菌效果定性试验。用含0.1 %吐温80生理盐水将菌种洗出，倒入灭菌培养皿中，用移液枪(枪头需经高压灭菌)吸取50 μL菌液放入盛有牛肉膏蛋白胨培养基的培养皿中，用涂布棒均匀涂抹，倒置10 min。再用移液枪分别吸取血根碱含量为0.96 mg/mL的各富硒化处理组药品10 μL，添加到直径为7 mm滤纸片(已高压灭菌)上，把滤纸片放入培养皿中，以青霉素钠、生理盐水为对照，每个培养皿放同种药品各个待测物滤纸片各1片，重复3次，置37 ℃恒温箱中培养18 h，观察测量，取平均值。

② 最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)测定：采用琼脂平板稀释法[4]测定富硒化博落回生物碱的MIC。用20 %的甲醇将定性试验中平均抑菌圈最小的一组富硒化博落回生物碱提取液，无硒处理博落回生物碱和青霉素钠分别稀释，富硒化博落回生物碱、无硒处理博落回生物碱的浓度分别为0.48、0.24、0.12、0.06、0.03 mg/mL；青霉素钠浓度分别为0.48、0.24、0.12、0.06、0.03 mg/mL。以20 %甲醇、生理盐水作为对照。将所培养的9种菌种稀释至1×105个/mL, 用多点接种器蘸取制备好菌液(约1～2 μL)接种于上述制备的平板培养基表面，每点菌数约100～200个，形成直径为8～10 mm的菌斑，置于37 ℃的恒温培养箱中培养24 h，重复操作3次，结果取平均值。

2 结果

2.1 富硒化博落回生物碱对不同菌种的抑菌效果 经富硒化处理博落回生物碱比对照组的抑菌效果有大幅度提高，且博落回生物碱抑菌效果，随植株中硒元素含量增加而提高。100 μg/mL亚硒酸钠处理组的平均抑菌圈(Φ15.33 mm)最小。结果见图1、表1。

图1 富硒化博落回生物碱的抑菌效果实物图1.0 μg/mL亚硒酸钠处理组；2.60 μg/mL亚硒酸钠处理组；3.80 μg/mL亚硒酸钠处理组；4.100 μg/mL亚硒酸钠处理组；5.120 μg/mL亚硒酸钠处理组；6.青霉素钠；7.生理盐水Fig.1 Inhibitory effect of se-Madeaya Cordate(Wild)R.Br alkaloids physical map1.0 μg/mL sodium selenite treatment group;2.60 μg/mL sodium selenite treatment group; 3.80 μg/mL sodium selenite treatment group;4.100 μg/mL sodium selenite treatment group; 5.120 μg/mL sodium selenite treatment group;6.penicillin sodium;7.saline

组别实验菌种E.coliP22B.choleraesuisS.suisE.coliO1S.aureusL.murrayiS.typhimuriumE.DublinB.subtilis平均值青霉素钠组0272940273.67生理盐水组0120111000.67亚硒酸钠处理组0μg/mL71211717151251511.2260μg/mL13171212192017122115.8880μg/mL14191312201819142316.89100μg/mL12171310181718122115.33120μg/mL16181311212018112116.56

0 μg/mL的亚硒酸处理组为空白对照，青霉素钠为阳性对照，生理盐水为阴性对照

2.2 富硒化博落回生物碱的最低抑菌浓度 在2.1项下的各实验组中，与其他处理组相比，100 μg/mL亚硒酸钠处理组的平均抑菌圈最小，故选取该组测定富硒化博落回生物碱最低抑菌浓度，见表2。

表2 富硒化博落回生物碱对种细菌的最低抑菌浓度,n=3)

CK1：生理盐水对照；CK2：20 %甲醇对照。“—”为无菌生长，“+”为少量菌生长，“+++”为大量菌生长

由表2可知，经富硒化处理博落回生物碱对以上细菌的最低抑菌浓度都有一定降低。其中，对E.coliO1、E.coliP22、E.Dublin的最低抑菌浓度为从原来0.96 mg/mL降低至0.24 mg/mL； 对S.typhimurium、B.choleraesuis的最低抑菌浓度为0.12 mg/mL；对S.aureus、S.suis的最低抑菌浓度为0.06 mg/mL；对B.subtilis和L.murrayi的最低抑菌浓度小于0.03 mg/mL，效果较好。

3 讨论

研究证明，作为中药材资源丰富的贵州省，其土壤全硒含量范围为0.064～1.326 mg/kg，平均值为0.369 mg/kg，高于世界(0.200 mg/kg)和全国(0.290 mg/kg)土壤平均硒含量[13]。贵州省内土壤局部达到富硒水平，适宜发展富硒中药材产业。同时，中药博落回在贵州有广泛分布，其生物碱具有一定的抑菌作用，除大肠杆菌以外，对于其他杆菌、球菌，革兰氏阴性和阳性菌均有极强的抑菌效果[1-2]。为了进一步改善博落回总生物碱的抗菌效果，提高其抗菌谱，本研究以硒元素作为添加剂，研究了富硒化处理博落回的抑菌效果。研究结果表明：与青霉素钠比对，富硒化处理的博落回生物碱对大肠杆菌、鼠伤寒杆菌、猪霍乱杆菌等9种细菌的抑菌效果得到显著增强，且其抑菌效果在一定范围内与亚硒酸钠浓度成正相关，亚硒酸钠浓度为100 mg/mL时其平均抑菌圈(Φ15.33 mm)最小；富硒化博落回生物碱的最低抑菌浓度均都有大幅的降低，尤其是大肠杆菌的最低抑菌浓度，从原来0.96 mg/mL降低至0.24 mg/mL；降幅显著。综上所述，富硒化有利于改善博落回的抑菌效果，为今后富硒博落回的开发利用，奠定了理论基础。

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(编校：王冬梅)

Study on the antibacterial effect of active ingredient of se-enriched Macleya cordata

WANG Ke-jia1, LIU Yun2, REN Yan-ling1Δ

(1.Guizhou Light Industry Technical College, Guiyang 550002, China; 2.Tongren Polytechnic College, Tongren 554300, China)

ObjectiveTo study on antibacterial effect of active ingredient of se-enriched Macleya cordata.MethodsPenicillin sodium and saline as control, detected the average inhibition zone diameter of se-enriched Macleya cordata group (containing 0.96 mg/mL sanguinarine) on 9 common bacteria with disc agar diffusion method;20% methanol and saline as control, se-enriched Macleya cordata group which the average inhibition zone diameter was minimum, without se-enriched Macleya cordata group and penicillin sodium were diluted with 20% methanol, made concentration of 0.48,0.24,0.12,0.06, 0.03 mg/mL. minimal inhibitory concentration (MIC) of each treatment group was determined by agar dilution method, evaluated antibacterial effect of se-enriched Macleaya cordata group. Resultsse-enriched Macleya cordata group could improve antibacterial effect significantly, the average inhibition zone of 100 μg/mL sodium selenite treatment group was minimum(Φ15.33 mm);MIC of se-enriched Macleya cordata group onE.coliO1,E.coliP22,E.Dublinreduced from 0.96 to 0.24 mg/mL; MIC ofS.typhimuriumandS.suiparewere 0.12 mg/mL; MIC ofS.aureusandS.suiswere 0.06 mg/mL; MIC ofE.DublinandL.murrayiwere less than 0.03 mg/mL. ConclusionSe-enriched Macleya cordata improves the antibacterial effect signififcantly, and it lays the theoretical foundation for development and utilization of se-enriched Macleya cordata for future.

selenium-enriched;Macleya cordata; sanguinarine;antibacterial effect

贵州省科学技术基金(黔科合J字[2013]2149号)

王珂佳，男，硕士，讲师，教务处副处长，研究方向：天然产物化学，E-mail：200811938@qq.com；任艳玲，通讯作者，女，博士，讲师，研究方向：植物病虫害及其防治和生态学，E-mail：43182481@qq.com。

R931.6

A

1005-1678(2015)05-0010-04