肝龙胶囊中总肽含量及其分子量分布的研究

那凯歌,满红霞,谭巧云,杨永寿,肖培云Δ

(1.大理学院 药学院，云南 大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000)



肝龙胶囊中总肽含量及其分子量分布的研究

那凯歌1,满红霞1,谭巧云1,杨永寿2,肖培云1Δ

(1.大理学院 药学院，云南 大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南 大理 671000)

目的 建立高效空间排阻色谱(high performance size exclusion chromatography，HPSEC)分析方法，测定肝龙胶囊中分子量分布并采用Lowry法测定其总肽含量。方法 采用superdex peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm)色谱柱，以pH=6.0、0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液为流动相，其中含有0.1 mol/L的NaCl；流速为0.7 mL/min；柱温25 ℃；检测波长214 nm。结果 总肽含量测定的线性范围为0.08～0.4 mg，r=0.9996；含量精密度试验的RSD为0%(n=6)，重复性试验的RSD为1.1%(n=6)。标准物质分子量的回归方程为logMr=5.1455-0.0871tR,r=0.9983, 分子量的线性范围为2.68×102～5.73×103Da,分子量精密度试验RCD为0.08%,重复性试验RSD为1.3%。结论 该方法准确、简便、快速，可作为肝龙胶囊的质量控制方法。

肝龙胶囊；空间排阻色谱法；总肽含量；分子量分布

“肝龙胶囊“是由药用昆虫美洲大蠊研发而成的昆虫类抗乙肝病毒(HBV)中药二类新药，美洲大蠊(Periplaneta americana)为昆虫纲有翅亚纲蜚蠊目蜚蠊科大蠊属昆虫,俗称“蟑螂”，其入药始载于《神农本草经》[1]，具有抗肿瘤、抗病毒、促进组织修复等作用[2-3]。研究表明，“肝龙胶囊” 具有抗病毒、抗氧化、防治慢性酒精性肝损伤、减少肝组织中MDA以及肝损伤后的大鼠血清中ALT、AST等指标含量的作用，用于治疗慢性乙型肝炎[4-6]。“肝龙胶囊”可抑制雏鸭体内鸭乙型肝炎病毒DNA的复制，可通过降低SGPT值发挥预防、保护肝损伤的作用[7]，并能增强机体免疫功能等作用[8]。“肝龙胶囊”的主要成分由肽、糖肽和氨基酸组成[9-11]，但其质量标准中缺乏对其分子量和总肽含量的测定方法，为了更好控制肝龙胶囊的质量，保证临床用药的安全、可控性，本文分别采用HPSEC法和Lowry法对其分子量、总肽含量分布进行检测，以期为“肝龙胶囊”的质量控制提供快速、可靠的检测方法，为临床用药提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药品 牛胰岛素(美国sigma公司，活力>27 U·mg-1，Mr=5733.49)；VB12(上海伯奥生物科技有限公司，含量≥98%，批号：080623，Mr=1355.37)；肌苷(上海蓝季科技发展有限公司，含量≥98%，批号：110115，Mr=268)；小牛血清白蛋白(北京索莱宝生物科技有限公司，含量≥98%，批号：703J051)；肝龙胶囊(昆明赛诺制药有限公司，批号：14012002、13101701、13062401)。

1.2 仪器与试剂 1200型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司，包括G1311A四元泵、G1329A自动进样器、G1316A柱温箱、G1314B紫外检测器)；UV2500紫外可见分光光度计(日本岛津仪器有限责任公司)；SK3200LH型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)；KL-UP-UV-20型超纯水机(成都康宁实验专用纯水设备厂)；AL240-IC型电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)。氯化钠(天津市瑞金特化学品有限公司，批号：20120427)；磷酸氢二钠(上海埃彼化学试剂有限公司，批号：F20131220)；磷酸二氢钠(北京凤翔科技有限公司，批号：20110805)；氢氧化钠(天津市福晨化学试剂厂，批号：20140818)；无水碳酸钠(天津市致远化学试剂有限公司，批号：20120406)；硫酸铜(广州市番禺力强化工厂，批号：20130219)；四水合酒石酸钾钠(杭州富强化工仪器有限公司，批号：20140310)；肝龙胶囊(昆明赛诺制药有限公司，批号：14012002、13101701、13062401)。

1.3 色谱条件 色谱柱为superdex peptide 10/300 GL(10 mm×300 mm)凝胶柱；流动相为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH=6.0，含有0.1 mol/LNaCl)；流速为0.7 mL/min；柱温 25 ℃；检测波长214 nm。

1.4 供试品溶液的制备：取肝龙胶囊内容物0.05 g，加入蒸馏水超声溶解，摇匀，定容至5 mL。过滤，除去辅料，用0.22 μm滤膜过滤后，用于分子量测定。取内容物0.02 g，精密加入蒸馏水4 mL，涡旋混匀，离心15 min，取上清液，用于含量测定。

1.5 对照品溶液的制备：称取标准物质牛胰岛素、VB12、肌苷适量，制成浓度分别为2 mg/mL、0.35 mg/mL、1 mg/mL的单标溶液，用于分子量测定。精密称取小牛血清白蛋白(ABS)标准品0.02 g，置于100 mL量瓶中，加水溶解，定容至刻度，摇匀，即得200 μg/mL的对照品溶液，用于含量测定。

1.6 含量测定方法学考察[12]

1.6.1 线性考察：精密移取ABS对照液0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0 mL置于10 mL量瓶中，加蒸馏水至2 mL，向其中分别加入碱性铜试剂(含0.5 moL/L NaOH，10% Na2CO3，0.1% NaKC4H406和0.05% CuSO4)1 mL，混匀，35 ℃温育10 min，取出冷却，向其中依次快速加入福林酚试剂B溶液(自制，取用时稀释8倍)4 mL，混匀，于55 ℃反应15 min，流水进行冷却。以对照液0 mL浓度为空白，照分光光度法(《中国药典》2010年版一部附录V A)于760 nm波长处测定吸光度。

1.6.2 精密度考察:取ABS液1.0 mL，同“1.4”项下处理方法，连续测定6次，以吸光度A考察该方法精密性。

1.6.3 重复性考察:取胶囊内容物约0.02 g，按“1.4”项下的方法平行制备6份供试品溶液，依法测定。以多肽含量(mg/粒)考察该方法重复性。

1.6.4 稳定性考察:分别在0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 h测定供试品溶液，以吸光度A考察该方法稳定性。

1.6.5 回收率考察：取胶囊内容物约0.01 g，按下表加入对照品，精密移入蒸馏水4 mL，涡旋混匀，离心15 min。精密吸取上清液0.2 mL进行测定。

1.6.6 样品含量测定：取3批样品，按已知方法制备供试品溶液，每批次平行3份，依法测定3。

1.7 分子量检测方法考察

1.7.1 标准曲线的绘制：吸取“1.5”项下的各单标溶液适量，混匀，过0.22 μm滤膜，按已知条件进样25 μL，记录色谱图。

1.7.2 精密度考察：取“1.5”项下的标准物质牛胰岛素(2 mg/mL)溶液，按已知色谱条件连续进样6次，进样量10 μL，以tR(min)考察该测定方法的精密度。

1.7.3 重复性考察：将同一批供试品溶液按已知条件在0 h重复测定6次，以tR(min)考察该方法重复性。

1.7.4 稳定性考察：将供试液分别在0、6、12、24、36 h进样，以tR(min)考察方法的稳定性。

1.7.5 供试品分子量测定：取三批肝龙胶囊试样，按“1.4”项下的方法制备供试液，按上述色谱条件进样20 μL，分别测定各组分峰的tR。将样品各峰的tR代入回归方程计算其平均分子量。

2 结果

2.1 总肽含量的测定

2.1.1 线性考察：以吸光度A对含量m(mg)进行线性回归，得标准曲线：A=1.9755 m+0.0775，r=0.9996(n=6)，见图1。色谱图，见图2。

图1 ABS线性回归图Fig.1 Linear regression graph of ABS

图2 供试品HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of sample

2.1.2 精密度考察：以吸光度A考察该方法精密性，RSD=0%，表明仪器的精密度良好。

2.1.3 重复性考察：重复性考察得平均含量为78.69 mg/粒，RSD=1.1%(n=6)。

2.1.4 稳定性考察：RSD=0.23%，表明该方法稳定性良好，。

2.1.5 回收率考察：回收率考察结果，见表1。

表1 回收率结果(n=6)Tab.1 Results of recovery(n=6)

2.1.6 样品含量测定：样品含量测定结果，见表2。

表2 肝龙胶囊总肽含量(n=3)Tab.2 The peptide content of Ganlong capsule (n=3)

2.2 分子量的测定

2.2.1 标准曲线的绘制：以标准物质出峰时间为横坐标，分子量的对数值(logMr)为纵坐标绘制标准曲线。由此得回归方程为logMr=5.1455-0.0871tR，r=0.9983，见图3。色谱图，见图4。

图3 标准物质线性回归图Fig.3 Linear regression graph of references

.对照品(1、2、3分别代表牛胰岛素、VB12、肌苷)图4 标准物质HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of references

2.2.2 精密度考察：经计算精密度RSD为0.08%，表明仪器的精密度良好。

2.2.3 重复性考察：经计算重复性RSD为1.3%，表明方法的重复性性良好。

2.2.4 稳定性考察：结果表明稳定性tR为1.4%，表明该方法稳定。

2.2.5 供试品分子量测定：供试品色谱图见图2，供试品分子量测定结果，见表3。

表3 样品分子量分布结果(n=3)Tab.3 Molecular weight distribution in sample(n=3)

3 讨论

本实验对分子量测定过程中的柱温和流速进行了考察，分别考察20、25、30 ℃以及0.6、0.7、0.8 mL/min的流速。结果表明，柱温和流速对检测结果无显著影响。由于凝胶色谱柱对柱压要求有严格的限定，经综合分析，本实验采用流速为0.7 mL/min、柱温25 ℃的条件进行测定。

本实验曾尝试以乙腈-水(含0.1%TFA)体系作为流动相进行测定，样品色谱图分离较好。而在选择牛胰岛素作为标准物质时，该物质色谱峰的峰形对称性较差，且乙腈的毒性大，价格贵，因此本实验最终选择磷酸盐缓冲液作为流动相。

测定总肽时，所用的碱性铜试剂需现用现配。由于福林酚试剂仅在酸性条件下稳定，但还原反应需在pH=10的条件下进行。故在加入福林酚试剂B时，应严格控制加入时间，且需立即混匀，以便磷钼酸-磷钨酸试剂在被破坏之前，发生还原反应。

本文采用HPSEC法测定总肽含量及肝龙胶囊分子量，具有操作简便、分析速度快等优点，适用于限度检查及相关物质的分析，可为肝龙胶囊的质量控制方法提供参考。

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(编校：王冬梅)

Research on the determination of molecular weight distribution and the peptide content of Ganlong capsule

NA Kai-ge1,MAN Hong-xia1,TAN Qiao-yun1,YANG Yong-shou2,XIAO Pei-yun1Δ

(1.Faculty of Pharmacy, Dali University, Dali 671000, China; 2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D, Dali 671000, China)

ObjectiveTo establish the molecular weight distribution of Ganlong capsule by HPSEC the content of the peptide determined by Lowry and MethodsThe superdex peptide 10/300 GL (10 mm×300 mm) column was used.The pH=6.0 and phosphate buffer of 0.05 mol/L was used as the mobile phase, containing 0.1 mol/L NaCl.The flow rate was set at 0.7 mL/min;The column temperature was 25 ℃;The detection wavelength was 214 nm.ResultsThe content of the peptide ranged from 0.08 mg to 0.4 mg(r=0.9996).The RSDs of measurement precision of molecular weight and content were 0.08% and 0%(n=6), respectively.The RSDs of the repeatability were 1.3% and 1.1%(n=6);The regression equation of standard material was logMr =5.1455-0.0871tR,r=0.9983,the relative molecular weight ranged from 2.68×102Da～5.73×103Da(r=0.9983).Conclusionon The method is simple and rapid for determining the peptide content and the molecular weight distribution of Ganlong capsule.It can be used quality control method for Ganlong capsule.

Ganlong capsule; size exclusion chromatography; peptide content; molecular weight distribution

国家自然科学基金项目(81360634, 81060329)；云南省教育厅重点项目(2011z053)

那凯歌，女，硕士，研究方向：生物药物分析，E-mail：599175992@qq.com；肖培云，通讯作者，女，教授，研究方向：药用昆虫研究，E-mail：xpy990120@126.com。

R927.2

A

1005-1678(2015)03-0159-03