马铃薯杂种无性株系的SSR 鉴定及花粉育性和染色体构型分析

王 丹，于肖夏，鞠天华，于 卓＊，郝治满，姜 超

（1 内蒙古农业大学 农学院，呼和浩特010019；2 赤峰天泽生物科技有限公司，内蒙古赤峰025457）

马铃薯是重要粮、菜、饲兼用作物，也是重要工业和能源原料。其营养价值高，富含淀粉、蛋白质、膳食纤维、维生素、酚类物质及钾、锌、硒、硫等营养元素［1－3］。随着中国马铃薯产业的迅速发展，专用型

和深加工型马铃薯品种的选育工作倍受重视［4－6］。内蒙古是中国重要的马铃薯种薯和商品薯生产基地。目前生产上运用的马铃薯品种对水肥条件要求较高，但其田间抗病能力弱，种薯退化周期短，特别是黑痣病、粉痂病、晚疫病等病害危害严重，马铃薯产量损失逐年增大［7－10］。因此，选育抗病性和适应性强、优质高产马铃薯品种非常必要。

通过分析比对子代与亲本在DNA 水平上的差异，可为马铃薯优良株系（或品系）选育和鉴定提供分子依据。如李长青等［11］利用3对SSR 适宜引物建立了3个马铃薯杂交组合共59个杂种株系的指纹图；甘霖等［12］利用ISSR 标记技术成功的鉴定了4个马铃薯杂交组合选出的23 个优良杂种株系。段艳凤等［13］利用6对SSR 引物将88份彩色马铃薯材料一一区分开来。马铃薯杂种株系花粉育性是判断其是否可作为杂交中间材料而进一步利用的重要细胞学依据，一般花粉可育率高于50%的杂种材料可作为父本利用，而低于50%适于作母本利用［14］。马铃薯杂种染色体配对行为与花粉育性的高低密切相关，通常二价体频率越高，表明染色体遗传相对稳定，相应的花粉育性亦越高［15］。

本课题组从美国引进了马铃薯材料‘MB09’（四倍体，2n＝4x＝48），并在内蒙古呼和浩特和赤峰地区种植观察发现，其产量高，品质好，生育期较短，薯形好，但其抗病性差。国内育成品种‘陇薯7号’（四倍体，2n＝4x＝48）具有抗病性和适应强、淀粉含量高、芽眼浅等优良特性，但生育期较长。为培育出抗病性和抗逆性强、优质高产的马铃薯新品种，我们按照遗传差异较大和优缺点互补的亲本组配原则，用‘MB09’材料作母本，‘陇薯7号’作父本，人工去雄授粉杂交，成功获得‘MB09’ב陇薯7号’杂种F1代共1 035个单株材料；通过田间试验观测，从中选出生长健壮、田间抗病性和适应性强的优良株系20个（无性系一代），进而对这20个杂种株系进行产量和品质等农艺性状测定分析，选出优异株系8个（无性系二代）。本试验采用SSR 分子标记技术对‘MB09’ב陇薯7 号’的20 个杂种株系进行DNA 指纹分析，并利用花粉染色镜检及卡宝品红染色体制片方法对其选出的8个优异株系的花粉育性及花粉母细胞染色体配对构型进行观察，为进一步马铃薯杂交新品系选育提供分子细胞遗传学依据。

1 材料和方法

1．1 供试材料

材料为马铃薯‘MB09’ב陇薯7号’杂种F1中选出的优良株系F1－1～F1－20（无性系一代）及从这20个株系中选出的株系F1－1、F1－2、F1－7、F1－11、F1－13、F1－14、F1－15和F1－20共8个优异株系（无性系二代）和其亲本。8个杂种株系的田间抗病性均较强，株型、薯型和生长势好，芽眼浅，还原糖含量均很低（鲜薯含量小于0．1%）。其中株系F1－7为高淀粉株 系（22．21%），株 系F1－2 和F1－20为 高 蛋 白 株 系（2．73%和2．96%），株系F1－11和F1－13均为高产株系（单株平均产量1．44kg和1．55kg）。各材料均由内蒙古农业大学马铃薯育种研究中心提供。

1．2 SSR 指纹图建立

1．2．1 DNA 提取与纯度检测 在苗期，选取22份马铃薯材料的幼嫩叶片，用天根生化科技有限公司生产的植物基因组试剂盒提取DNA，1．6%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA 纯度后，将各材料的DNA 浓度稀释到50ng／μL 左右，置冰箱中保存备用。22个马铃薯材料的基因组DNA 电泳条带清晰均匀，无拖尾现象，DNA 纯度高，符合SSR 分析的要求。

表1 SSR－PCR反应体系Table 1 SSR－PCR reaction system

表2 SSR 适宜引物及其碱基序列Table 2 SSR suitable primers and their nucleotide sequences

1．2．2 SSR－PCR扩增反应体系及程序 SSR 扩增反应体系详见表1。反应程序为95 ℃预变性1个循环，时间为4min；94℃变性30s，56℃退火45s，72 ℃延伸90s，34个循环；72 ℃延伸10min，1个循环后终止反应［12］。试验所用PCR 仪为Bio－rad T00Thermal Cycler。

1．2．3 电泳及银染 对PCR 扩增产物进行电泳，PAGE 凝胶浓度为6%，样孔加样量6μL，Marker为DL100，功率70W，电泳时间1h。电泳完毕后将胶板放入固定液（蒸馏水2L、酒精200mL、冰乙酸20mL）中固定15min，蒸馏水漂洗3min，用1．5%AgNO3溶液染色15min后放入蒸馏水中速漂5s，置显影液（蒸馏水2L、NaOH 60g、甲醛10mL）中显色10min，蒸馏水漂洗，自然晾干后扫描胶板［14］。

1．2．4 SSR 适宜引物筛选 用亲本及其20个杂种F1无性株系的基因组DNA 为模板筛选SSR 适宜引物，试验所用的40对SSR 引物碱基序列来源于NCBI网站公布的马铃薯特异性引物，委托上海生工有限公司合成。通过PCR 扩增从中选出多态性丰富、条带清晰稳定的2对SSR 适宜引物（表2）。

1．3 花粉育性鉴定

在马铃薯开花盛期，田间随机取亲本及其8个优异杂种株系的花药带回室内镜检。在载玻片上用镊子挤压花药，使花粉散出，滴加1．0%的醋酸洋红，在OlympusBX51的10×10倍显微镜下观察并统计可育花粉和不可育花粉数，每份材料观察50个视野左右。观察标准：可育花粉染色深、花粉粒较大、饱满、形状有规则；不育花粉染色浅或者是没有染上色、花粉空瘪、形状无规则。花粉可育率（%）＝（可育花粉粒总数／观察的花粉粒总数）×100%［15］。

1．4 花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ（PMCMⅠ）染色体观察

在马铃薯现蕾初期，取8个优异杂种株系及其双亲的幼小花蕾若干，置于装有卡诺液（无水乙醇∶冰醋酸＝3∶1）的广口瓶中，4℃冰箱中固定22～24 h后，用清水洗净放入70%酒精中保存备用。制片时，在载玻片上用解剖针将花蕾挑开挤出花药，去除杂质，滴加卡宝品红染色，放盖玻片用镊子轻敲，使细胞分散均匀后压片，Olympus BX51 显微镜下观察统计PMCMⅠ染色体数并照相［16］。

2 结果与分析

2．1 杂种F1 无性株系的SSR 指纹分析

利用筛选出的SSR 引物C57和S25对20个杂种株系及其亲本PCR 扩增结果如图1 所示。20个株系的SSR 指纹图与双亲间均产生互补型条带及新的特征带或缺失型条带，其中引物C57扩增出互补型条带及新的特征带的株系为F1－1～F1－3、F1－5、F1－7～F1－20，扩增出缺失型条带的为F1－4和F1－6；引物S25扩增出互补型条带及新的特征带的株系为F1－1、F1－2、F1－4～F1－6、F1－9～F1－20，扩增出缺失型条带的为F1－3、F1－7和F1－8。这从DNA 水平证明它们均为真实的杂种株系。另外，株系F1－12和F1－17的SSR 指纹一致，说明引物C57能把90%的杂种株系识别出来，而引物S25扩增的SSR 指纹图可将这20个株系完全区别开来。由于不同引物在杂种株系间扩增出的SSR 指纹图不完全相同，因此在马铃薯杂种株系鉴定及DNA 指纹图建立时最好选用2对以上引物。

图1 引物C57（A）和S25（B）对‘MB09’ב陇薯7号’杂种F1 无性株系扩增的SSR 指纹图M．DL100DNA；P1．‘MB09’；P2．‘陇薯7号’；1～20．‘MB09’ב陇薯7号’杂种F1Fig．1 SSR fingerprint of F1hybrid lines from‘MB09’בLongshu 7’amplified by primer C57（A）and S25（B）M．DL100DNA；P1．‘MB09’；P2．‘Longshu 7’；1－20．F1hybrid lines of‘MB09’בLongshu 7’

2．2 杂种F1 优异株系花粉育性差异分析

8个杂交株系间的花粉可育率不同，株系F1－1、F1－13、F1－14间差异不显著，但它们与株系F1－2、F1－7、F1－15、F1－20间均达到极显著差异（图2和表3）。父本‘陇薯7号’花粉育性为83．33%，母本‘MB09’为20．45%（最低），其中F1－7 的花粉育性 最高，达87．08%，且与其母本差异极显著；其余优异株系的花粉可育率变幅为36．73%～77．78%，介于双亲之间。根据8个株系育性程度，在今后的杂种育种中可作为中间材料进一步利用，其中株系F1－1、F1－13、F1－14和F1－15适于作母本利用，而株系F1－2、F1－7、F1－11和F1－20适宜作父本利用。

表3 8个杂种株系及其亲本花粉育性Table 3 The pollen fertility of 8hybrid lines and their parents

图2 8个优异杂种株系及其亲本的花粉育性P1．‘陇薯7号’；a．F1－1；b．F1－2；c．F1－7；d．F1－11；e．F1－13；f．F1－14；g．F1－15；h．F1－20；P2．‘MB09’Fig．2 The pollen fertility of 8excellent hybrid lines and their parents P1．‘Longshu 7’；a．F1－1；b．F1－2；c．F1－7；d．F1－11；e．F1－13；f．F1－14；g．F1－15；h．F1－20；P2．‘MB09’

图3 8个优异杂种株系及其亲本的PMCMⅠ染色体配对行为1．‘陇薯7号’；2．F1－1；3．F1－2；4．F1－7；5．F1－11；6．F1－13；7．F1－14；8．F1－15；9．F1－20；10．‘MB09’Fig．3 The chromosome pairing behavior of 8excellent hybrid lines and their parents at PMCMⅠ1．‘Longshu 7’；2．F1－1；3．F1－2；4．F1－7；5．F1－11；6．F1－13；7．F1－14；8．F1－15；9．F1－20；10．‘MB09’

表4 8个杂种株系及亲本花粉母细胞分裂中期ⅠPMCMⅠ染色体配对构型Table 4 Chromosome configuration of 8hybrid lines and their parents at PMCMⅠ

2．3 杂种F1 优异株系PMCMⅠ染色体构型分析

亲本间的PMCMⅠ染色体配对构型差异明显（图3和表4）。其中母本MB09 的二价体频率较低，且棒状二价体较多，染色体配对构型为12．11Ⅰ＋3．93Ⅱ＋3．74Ⅲ＋4．21Ⅳ；父本陇薯7号的二价体频率较高，且以环状二价体为主，染色体配对构型为1．25Ⅰ＋13．52Ⅱ＋0．94Ⅲ＋4．42Ⅳ。

与双亲相比，8个优异杂种株系的染色体配对构型明显不同。株系F1－2、F1－7、F1－11和F1－20的二价体频率为72．38%～82．91%，与父本（80．36%）接近，并以株系F1－7（82．91%）最高，且以环状二价体为主，其染色体配对构型分别为2．01Ⅰ＋12．15Ⅱ＋3．67Ⅲ＋2．67Ⅳ、1．42Ⅰ＋14．63Ⅱ＋1．13Ⅲ＋3．48Ⅳ、1．96Ⅰ＋13．47Ⅱ＋1．85Ⅲ＋3．38Ⅳ和2．36Ⅰ＋11．66Ⅱ＋3．83Ⅲ＋2．71Ⅳ；株系F1－1、F1－13、F1－14和F1－15的二价体频率为49．13%～62．18%，介于双亲之间，并均以棒状二价体为主，其染色体配对构型分别为4．75Ⅰ＋9．79Ⅱ＋4．98Ⅲ＋2．18Ⅳ、5．67Ⅰ＋8．80Ⅱ＋5．15Ⅲ＋2．32Ⅳ、5．03Ⅰ＋9．53Ⅱ＋5．20Ⅲ＋2．08 Ⅳ和7．12Ⅰ＋7．36Ⅱ＋6．31Ⅲ＋1．81Ⅳ。将该结果进一步与上述花粉育性情况比较表明，二价体频率高的杂种株系，其花粉育性也高，反之则花粉育性低，这为优异杂种株系育性评价利用提供了细胞遗传学依据。

3 讨 论

杂种无性株系真实性鉴定是马铃薯新品种选育的重要环节，有研究表明不同的SSR 引物在马铃薯杂种株系间扩增出的指纹特征不同，可分为‘偏母型’、‘偏父型’、‘杂种型’和‘双亲互补型’4种类型，其中‘双亲互补型’是鉴定杂种株系与亲本的最佳类型［17］；李长青等的研究认为，在马铃薯杂种株系SSR 标记双亲互补的基础上常产生一些缺失或非双亲的新特征带，可看作是双亲互补型的新类型，这可能是在减数分裂过程中同源染色体复制时部分碱基发生基因突变或发生染色体交换和配对引起的［11，18］。本试验利用筛选出的2对SSR 特异引物C57和S25对‘MB09’ב陇薯7号’杂种F1中选出的20个优良株系基因组DNA 扩增的SSR 指纹图显示，同一杂种株系用不同SSR 引物扩增出的指纹特征不同，不同杂种株系用同一SSR 引物扩增出的指纹亦不同，据此认为在马铃薯杂种株系鉴定时，除考虑以上双亲互补型、缺失型和新类型外，还可以结合亲本及其杂种株系的SSR 指纹差异进行判定，若杂种株系与双亲的DNA 指纹明显不同，即可将其认定为真实的杂种株系，而引起不同杂种株系间的DNA 指纹差异的原因还有待深入研究。另外，本试验中用引物S25可将20个杂种株系及其与亲本完全区别开来，而用引物C57只能区分90%的杂种株系，因此在建立马铃薯杂种株系DNA 指纹图时应选用2对以上SSR 特异引物。

花粉母细胞的减数分裂过程较为复杂，受到一系列基因的精准控制，不论这些基因中的哪一个发生倒位、断裂等变异，均会导致减数分裂发生异常，细胞内的遗传物质发生变化，最终导致花粉败育［19］。不少学者在水稻［20，21］、玉米［22］、大豆［23］等作物上的研究表明，花粉败育的主要原因是杂种F1花粉母细胞减数分裂时，因染色体组来自不同亲本，在染色体组之间出现不平衡现象，如单价体、落后染色体和微核等导致杂种不育，因此在减数分裂时二价体出现频率越高，其花粉育性越高。本试验对‘MB09’ב陇薯7号’的8个优异杂种株系花粉母细胞PMCMⅠ染色体构型及其花粉育性观测亦表明，二价体频率高的株系其花粉育性亦高，这与前人研究结果一致，为马铃薯杂种株系进一步作为杂交中间材料利用提供细胞遗传学依据。

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