鸭儿芹羟基肉桂酸转移酶基因的克隆及其对不同温度的响应

吴雪君，谭国飞，徐志胜，王 枫，熊爱生

（南京农业大学 园艺学院，作物遗传与种质创新国家重点实验室，农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，南京

210095）

木质素是陆生植物中重要的聚合物，仅次于纤维素。木质素主要有3种单体类型：对－羟基苯基木质素（P－hydroxyphenyl lignin，H－木质素）、愈创木基木质素（guaiacyl lignin，G－木质素）和紫丁香基木质素（syringyl lignin，S－木质素）［1］。木质素属于酚类高分子化合物，存在于木质部中，不仅有利于植物运输水分，而且能增加细胞壁厚度，增强植物机械支持 力［2－3］。羟 基 肉 桂 酰 转 移 酶（hydroxycinnamoyl－CoA）作为细胞色素P450家族的成员之一，同时具有莽草酸羟基肉桂酰转移酶（shikimate hydroxycinnamoyl－transferase）和奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（quinate hydroxycinnamoyl－transferase）活 性，该酶在木质素的生物合成进程中研究较晚［4－5］。莽草酸／奎宁酸羟基肉桂酰转移酶（shikimate／quinate hydroxycinnamoyl－transferase，HCT）是催化对－香豆酰辅酶A 生成咖啡酰辅酶A 的关键酶，在苯丙烷C3羟基化的上、下游起着重要的双重调节作用［6－7］。莽草酸／奎宁酸羟基肉桂酰转移酶也是H－木质素和G／S－木质素合成时进行相互转化的调控物质。在高等植物中，P450家族成员在一些物质的生物合成中发挥重要的作用，例如苯丙烷类、生物碱、萜类、生氰糖苷类、激素等［7－8］。编码HCT 的基因与很多其他P450基因家族成员一样，表达受外界环境诱导，如：辐射、机械损伤、高温低温和化学诱导剂等［9－10］。

鸭儿芹（Cryptotaenia japonica Hassk），为伞形科（Apiaceae）鸭儿芹属（Crypototaenia）的药食两用植物，嫩苗叶及叶柄可供蔬食，是一种较为重要的蔬菜［11］，已成为日本十大蔬菜之一。主产河北、安徽、江苏、浙江、贵州、福建、江西、广东、广西、湖北、湖南等地，喜生于林下阴湿处。全草及果可入药，有祛风止咳、活血化瘀、消炎止痒之功效，治感冒咳嗽、肺炎、肺囊肿、淋病、疝气、风火牙痛等。目前，生产上栽培种多为引自日本的白茎（柄）鸭儿芹［12］。野生鸭儿芹在进行夏季栽培时，往往会受到高温的影响，导致食用器官木质化，严重影响鸭儿芹的品质，低温虽然能延迟木质素的产生，但影响鸭儿芹产量［13］。

本研究以贵州鸭儿芹为研究对象，克隆与木质素合成相关的CjHCT 基因，并对其组织特异性及生长过程中主要面临的4种不同温度进行不同时间段处理，通过实时荧光定量PCR 检测该基因的表达情况，为中国鸭儿芹人工栽培温度调控提供参考。

1 材料和方法

1．1 植物材料及处理

实验材料为本实验室保存的贵州省野生鸭儿芹种子，种子催芽后，种植于南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点实验室人工气候室。取2月龄鸭儿芹植株，剪取其生长健康的第4片叶片用于叶片总RNA 提取，反转录成cDNA，用于克隆CjHCT基因。并对2月龄植株分别进行10℃、18℃、30℃和38 ℃处理0、0．5、1、2、4、8、12和24h，提取第4片成熟真叶叶片组织和叶柄组织的RNA，反转成cDNA，用于实时定量PCR。

1．2 方 法

1．2．1 鸭儿芹CjHCT 基因克隆 利用RNA simple Total RNA Kit（北京Tiangen公司）试剂盒，按照其说明书的步骤提取鸭儿芹总RNA：利用Prime Script RT reagent Kit（大连TaKaRa公司）试剂盒，按照说明书将提取的总RNA 反转录成cDNA。

以毛白杨HCT 基因（登录号XM＿006368430．1）［14］和拟南芥HCT 基因（登录号NM＿124270．3）［15］为参考序列，将两条参考序列进行比对。根据比对结果，用Premier 5．0软件在两条参考基因序列较一致区域，开放阅读框（open reading frame，ORF）外设计上游引物CjHCTF（5′－ATACTTTCTCCACCTACTTTCACC－3′）和 下 游 引 物CjHCTR（5′－GTGCGTGTCTTCAAATGTCATAC－3′）。PCR 克 隆 反 应 条件为94 ℃预变性4min，然后94℃变性30s，54℃退火60s，72 ℃延伸1．5min进行35个循环，最后72 ℃延伸10 min。用1．2%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR 产物。回收后的PCR 产物连接到pMD19－T 载体上，并转化到大肠杆菌DH5α。随后进行质粒的酶切与鉴定，委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行DNA 测序。

1．2．2 序列分析 将克隆得到的CjHCT 基因，利用BioXM 2．6软件对其可阅读框长度进行预测，并翻译成对应的氨基酸序列。利用NCBI 网站的GenBank数据库中的BLAST 程序，进行CjHCT基因和氨基酸序列的同源性分析；采用DNAMAN软件对CjHCT 基因和氨基酸序列进行多重比对、蛋白相对分子质量、等电点和酸碱氨基酸统计等分析；用MEGA5 软件绘制进化树并进行编辑成图［16］；用 ExPASy 的SWISS－MODEL WORKSPACE（http：／／swiss－model．expasy．org）程序预测CjHCT 蛋白三维结构。

1．2．3 实时定量PCR反应和基因表达分析 实时定量PCR 采用SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（TaKa－Ra公司），按照操作说明进行。相对定量使用参照基因的ΔCT法，表达差异等于2－ΔCT，ΔCT＝CT目标基因－CTactin。相对定量是基于处理和对照之间目标基因对参考基因表达量的比较。采用iQTM5software和iQTM5Real－time PCR System 完成荧光定量PCR。根据克隆到的CjHCT 基因序列，设计荧光定量检测引物，上游引物CjHCTBDF（5′－CGTCGGAATCTGTGGAACGCTAA－3′）和下游引物CjHCTBDR（5′－CCTCCCAGCCATAGGATAGAACG－3′）。用鸭儿芹actin基因作为内参基因，其引物为actinF（5′－CTGCAAAGAGCAGCTCTTCTGTGGA－3′）和actinR（5′－TGTAAGTTGTCTCGTGGATTCCTGC－3′）［13］，目 标 基 因与actin基因一起扩增。基因表达情况及分析采用Microsoft Excel 2007和IBM SPASS 20．0进行［13］。

2 结果与分析

2．1 鸭儿芹CjHCT 基因的克隆

以鸭儿芹cDNA 为模板进行克隆，得到一条约1 400bp的扩增产物（图1），将克隆得到的第1～3泳道目的基因条带的产物进行测序。测序结果显示，3个泳道获得的CjHCT 基因序列结果一样，长度均为1 410bp。通过预测，其开放阅读框为1 290 bp，可编码429个氨基酸（图2）。进一步分析显示，其中酸性氨基酸为72个，碱性氨基酸为54个，蛋白分子质量为47．58kD，等电点为6．67。通过对其蛋白质亲水／蛋白质疏水性预测可知，该蛋白质亲水性区域多于疏水性区域，该蛋白质可能属于亲水性蛋白质。

2．2 鸭儿芹与其他植物CjHCT氨基酸序列比较

图1 鸭儿芹CjHCT 基因的克隆M．DL2000；1～3．PCR 扩增产物Fig．1 PCR amplification of CjHCTgene fromC．japonica Hassk M．DL2000；1－3．Products of PCR

将获得的CjHCT 翻译成对应的氨基酸序列，与胡萝卜（Daucus carota，GenBank登录号KR559236）、拟 南 芥（Arabidopsis thaliana，GenBank 登 录 号ABH04595．1）和 番 茄（Solanum lycopersicum，Gen－Bank登录号XP＿004235891．1）HCT氨基酸序列进行比较。四者HCT 基因开放阅读框长度不同，编码氨基酸长度也不相同（图3）。其中伞形科鸭儿芹和胡萝卜HCT 基因均编码429个氨基酸，拟南芥HCT 基因编码433个氨基酸，番茄HCT 基因编码435个氨基酸。四者氨基酸序列一致性高达89．77%，其中鸭儿芹HCT氨基酸与胡萝卜的一致性为96．06%，而鸭儿芹HCT氨基酸与番茄一致性为79．57%，与拟南芥一致性为75．49%。说明同属于伞形科的胡萝卜与鸭儿芹HCT 氨基酸进化关系较近。鸭儿芹CjHCT蛋白三级结构预测与分析利用SWISS－MODEL，以中粒咖啡HCT（PDB ID：4g2m．1）为模型对推导的氨基酸序列同源建模，预测了该蛋白的三级结构。结果（图4）显示，鸭儿芹CjHCT蛋白结构序列与中粒咖啡HCT有85．31%的一致性。

图2 鸭儿芹CjHCT 基因序列及编码氨基酸序列＊表示终止密码子Fig．2 Nucleotide acid and deduced amino acid sequences of CjHCTfromC．japonica Hassk＊represents the stop codon

图3 不同植物和鸭儿芹CjHCT 氨基酸序列比对Fig．3 Alignment of amino acid sequences of HCT fromC．japonica Hassk and other plants

2．3 CjHCT的进化分析

为了进一步研究CjHCT 进化的关系，将鸭儿芹CjHCT 氨基酸序列与其它25种植物的HCT 氨基酸序列构建进化树（图5）。结果表明：同为伞形科的胡萝卜与鸭儿芹进化关系较近，不同科植物中的CjHCT 氨基酸进化较保守，如豆科的大豆、蝶豆、红车轴草、鹰嘴豆和银合欢在同一分支上，茄科的番茄、马铃薯、绒毛烟草和普通烟草在同一个分支上。

图4 利用SWISS－MODEL对鸭儿芹CjHCT 蛋白质三级结构预测Fig．4 Tertiary structure prediction of the CjHCT fromC．japonica Hassk by SWISS－MODEL

2．4 CjHCT 基因在不同组织中的表达分析

分别取鸭儿芹植株的根、叶柄、叶、花组织，通过荧光定量PCR 检测CjHCT 基因在不同组织的表达情况。结果表明，CjHCT 基因在鸭儿芹根中表达量最高，其次为叶柄，叶和花中表达量最低（图6）。根中的表达量分别为叶和花的7．826和7．706倍，叶柄中表达量分别为叶和花的4．496和4．429倍。

2．5 鸭儿芹CjHCT 基因在不同温度下的表达

为了研究温度对鸭儿芹产生的影响，取其2月龄健壮幼苗于不同温度下分别处理不同时间，荧光定量PCR 检测CjHCT 基因在叶片和叶柄中的相对表达量（以0h为对照，表达量设为1）。

图5 不同植物HCT 进化树标尺代表遗传距离Fig．5 Phylogenetic tree of amino acid sequences of the HCT from different plants species The scale bar represents genetic distance

叶片检测结果表明（图7），在0．5h时，10 ℃时表达量下调，而18 ℃、30 ℃和38 ℃处理表达量较高，其中30 ℃处理表达量远高于其他处理，提高达到24．89倍，而10 ℃、18 ℃、38 ℃处理下表达量 比对照分别提高0．26、3．33、9．04倍。在1h时，18 ℃处理表达量下调，而在30 ℃和38 ℃处理下表达量较高，38 ℃处理表达量最高。在2～4h时，18 ℃和38 ℃处理表达量相似，而且10 ℃和30 ℃处理的表达量均高于前两者，30 ℃处理表达量最高。而在8～12h时，30 ℃和38 ℃处 理 表 达 量 下 调，30 ℃处理表达量最低。但在12h时，所有处理的表达量都高于8h处理。在24h时，38 ℃处理表达量最低，10 ℃、18 ℃和30 ℃处 理 下 表 达 量 都 高 于38 ℃处理。在10 ℃和18 ℃处理下CjHCT 基因的相对表达量在12h时达到峰值，且18 ℃处理表达量较低。在10 ℃和18 ℃处理下CjHCT 基因的相对表达量在24h时降低。在30 ℃与38 ℃处理下CjHCT 基因的相对表达量在0．5h时达到峰值，且30 ℃下表达量较高。

图6 鸭儿芹不同组织中CjHCT 基因的相对表达不同大小写字母分别表示0．01和0．05水平差异显著性Fig．6 Relative expression levels of CjHCTgene in different tissues of C．japonica Hassk Values with different normal and capital letters mean significant difference at 0．05and 0．01levels

图7 不同温度处理下鸭儿芹叶片中CjHCT 基因的相对表达水平同一温度处理不同大小写字母分别表示0．01和0．05水平差异显著性；下同Fig．7 Relative expression analysis of CjHCTgene in C．japonica Hassk leaves with different temperature treatments Values with different normal and capital letter mean significant difference at 0．05and 0．01level under the same temperature treatment．The same as below

叶柄检测结果表明（图8），10 ℃处理表达量全部下调，且在4～24h时表达量较为相近，2h处理表达量为该温度下所有处理表达量峰值，与对照相比无极显著性差异。18 ℃处理表达量全部上调，且在0～4h时表达量随着时间的延长而增加，在1h时表达量与对照相比已有极显著性差异。30 ℃和38 ℃处理在0．5h时表达量均上调且有极显著性差异，其中38℃比30℃处理表达量更高，分别提高3．02和2．44倍；在1h时，38 ℃和30 ℃处理表达量相似；在2h 时，前者表达量最高，提高到3．55倍。在18 ℃处理下，CjHCT 基因的相对表达量在4h时达到峰值；在30℃处理下，CjHCT 基因的相对表达量在0．5h 时达到峰值；在38 ℃处理下，CjHCT 基因的相对表达量在2h 时达到峰值，且0．5h时表达量高于30℃处理下CjHCT 基因的相对表达量。

3 讨 论

CjHCT 基因在植物木质素合成中具有重要作用［17－20］。木质素的合成过程需要受到多个基因的调控，是一个复杂的过程。当该过程中某个酶的表达活性降低时，其他酶的表达活性也会受到影响［21－22］。木质素3种单体的合成均起始于莽草酸代谢中生成的苯丙氨酸（phenylalanine），苯丙氨酸通过苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）生成反式肉桂酸（trans－cinnamic acid）。此外，在该生物合成进程中，对－香豆酰辅酶A 在羟基肉桂酸转移酶（HCT）和肉桂酸－3－羟化酶（C3H）的催化下，最终合成咖啡酰辅酶A（caffeoyl CoA）。咖啡酰辅酶A 在O－甲基转移酶（OMT）和阿魏酸－5－羟化酶（F5H）的作用下，依次生成阿魏酰辅酶A（feruloy－l CoA）和5－羟 基 阿 魏 酰 辅 酶A（5－hydroxyferuloy－l CoA）。5－CoA苯环上5位的羟基被OMT家族的COMT 或CCoAOMT 甲基化后，经肉桂酰辅酶A 还原酶（CCR）和肉桂醇脱氢酶（CAD）的催化后形成木质素的直接单体［23］。例如，研究表明转基因烟草中PAL 表达活性降低后，木质素的含量也随之降低，但是该烟草的正常生长发育被抑制［24］。如果以植物能够进行正常生长为条件，以降低木质素含量，提高S／G（紫丁香基木质素／愈创木基木质素）比值等为衡量标准，那么C4 H、HCT、CCoAOMT、F5 H 和CAD 等都是可用的理想基因。例如在苜蓿中 利 用 反 义RNA 技 术 抑 制C3 H、C4 H 和COMT的表达会使木质素的含量明显降低，提高单体比值［25］。还有一种被称为O－甲基转移酶的物质，即咖啡酰辅酶A－3－O－甲基转移酶（CCoAoMT），当采用反义RNA 技术抑制烟草CcoAOMT 活性时，会使木质素的含量降低并且改变其组分成分。例如紫丁香基木质素会有所增加［26－27］。Sewalt又对抑制PAL 或C4 H 表达转基因烟草进行了进一步的研究并加以比较，结果表明在烟草中反义转入PC4 HCCoAOMT 基因，能有效降低木质素的含量［28－29］。

人工栽培鸭儿芹的目的是为了采摘其嫩叶和叶柄，延缓鸭儿芹木质素的合成有利于提高鸭儿芹品质。在叶柄处理较低温度（10 ℃和18 ℃）时基因表达量比较高温度（30 ℃和38 ℃）时基因表达量更低更慢，根据苜蓿中的研究可以推测出，较低温度处理时鸭儿芹中木质素含量可能减少［1］。该实验意义在于初步研究低温栽培鸭儿芹能抑制其体内CjHCT基因的表达，与鸭儿芹为冷凉性蔬菜的结论一致［11］。鸭儿芹栽培过程中，高温促进鸭儿芹的生长发育，且较易导致鸭儿芹木质化程度提前出现，同时温度过高，也会阻碍鸭儿芹生长发育，低温虽然延迟木质素的合成，也会出现鸭儿芹生长发育不良，产量低等现象［23］。因此还需要进一步研究温度对鸭儿芹生长发育的影响，为人工种植鸭儿芹温度控制提供借鉴。

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