盐胁迫下盐穗木甘油醛－3－磷酸脱氢酶基因的表达与亚细胞定位分析

张 霞，张 桦，张富春

（1 新疆农业大学 农学院，乌鲁木齐830052；2 新疆大学 生命科学与技术学院，新疆生物资源与基因工程重点实验室，乌鲁木齐

830046）

甘油醛－3－磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase；GAPDH）为糖酵解关键酶之一［1］。在哺乳动物细胞中，GAPDH 除了参与糖酵解途径外，还参与多种非代谢类生物过程，包括转录调节、DNA 修复、信号传导、自噬和凋亡［2－5］。最近研究表明H2O2或脱落酸（ABA）处理会抑制拟南芥（Arabidopsis thaliana）GAPDH（AtGAPDH）作为甘油醛－3－磷酸脱氢酶的酶活性，这种失活的GAPDH 蛋白会提高磷脂酸（PA）的含量，后者可以作为信号分子参与对干旱或ROS 等胁迫产生应答［6］。在众多植物中，如匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera）、拟南芥、水稻（Oryza sativa）、小麦（Triticum aestivum）、黄瓜（Cucumis sativus）、番茄（Solanum chilense）等，GAPDH 均被鉴定为盐胁迫诱导蛋白［7］；前期工作中，通过藜科（Chenopodiaceae）盐穗木（Halostachyscaspica）盐胁迫下抑制差减文库获得盐胁迫相关基因，其中包括甘油醛－3－磷酸脱氢酶（HcGAPDH，GenBank Accession No．Hs586460）［8］，表明GAPDH 参与植物盐胁迫应答在植物界是一个普遍现象。此外，在植物中，碳水化合物的水平将植物外界环境状况与细胞内的发育进程联系在一起［9－10］。而GAPDH 作为糖酵解途径中的酶，在动物细胞中能够精准感受到细胞内碳水化合物的水平［1］。Zheng等［3］推断GAPDH 可能作为一种信号分子，通过细胞质到细胞核的亚细胞定位的改变，将人源细胞质中氧化状态（或是新陈代谢状态）与一些相关基因的转录联系在一起。虽然蛋白质学和瞬时表达绿色荧光蛋白融合蛋白的研究表明拟南芥GAPDH 蛋 白 在 胁 迫 中 定 位 于 细 胞 核 中［11－13］。但GAPDH 是否在生物界（包括植物和动物）中具有相同生理功能还有待进一步探讨。

盐穗木为多汁半灌木、荒漠主要组成植物之一，盐穗木群系为塔里木河中下游区域耐盐性最强的植物种群［14］。其隶属的藜科包含世界上大多数盐生植物种类［15］，故盐穗木是一种典型的盐生植物。目前对于大多数盐生植物的研究还处于起步阶段，多集中在转录本、抑制差减文库、或蛋白文库等大规模批 量基因 筛 选 层 面［8，16，17］，对 于 单 个 基 因 或 蛋 白 的功能研究较少。为了研究HcGAPDH 在盐穗木盐胁迫应答中的作用，首先通过RACE 技术获得Hc－GAPDH 全长cDNA 序列，并借用实时定量PCR检测了HcGAPDH 在盐穗木逆境胁迫中的转录水平，同时借助转基因和激光共聚焦显微镜技术检测不同生理状态下HcGAPDH 的亚细胞定位。本研究为深入探讨HcGAPDH 在盐穗木盐胁迫应答中的作用机理奠定了一定基础。

1 材料和方法

1．1 植物材料及胁迫处理

拟南芥（Col生态型）生长在22 ℃、16h光照／8 h黑暗、60%湿度培养箱中。盐穗木种子采自新疆北沙窝盐碱地，手工去掉种子外壳，筛净，进行湿种子灭菌（75%乙醇表面消毒1min，0．1%升汞消毒8 min，无菌水冲洗7遍以上）。用滴管将处理好的盐穗木种子点在MS固体培养基中，用封口膜封紧；4℃3d后，于培养箱中培养4周用于后续实验，期间采用变温培养（正常光照，28 ℃16h；无光照，16 ℃8h）。4 周大的幼苗分别在150 mmol／L NaCl和100μmol／L ABA 的平皿中放置0、3、6、12和24h，用液氮将盐穗木幼苗收集，置－80 ℃待用。

1．2 实时定量PCR（RT－PCR）

采用植物总RNA 提取试剂盒（Tiangen）提取盐穗木全株总RNA，置于－80 ℃冰箱保存。按PrimeScript RT－PCR试剂盒（TaKaRa）的操作指南进行cDNA 合成。实时定量PCR 由Rotor－Gene 7500实时定量PCR 仪（Corbett Research，澳大利亚）完成。选择盐穗木actin 基因作为内参基因，盐穗木BURP家族的脱水胁迫蛋白22（HcRd22）作为胁迫处理盐穗木的标记基因［18］，采用SYBRRrogen I real－time PCR 体系（invitrogen）进行。反应程序为：95 ℃预变性30s；95 ℃变性5s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30s，共40个循环。在ABI 7500 荧光定量PCR 仪上进行扩增。使用2－ΔΔCt方法［19］计算相对表达量。3个重复。

1．3 基因克隆与拟南芥转化

根据盐穗木盐胁迫下抑制差减文库中分离获得HcGAPDH 基因的表达标签（EST）片段［8］，利用SMARTer RACE5’／3’Kit（invitrogen）试剂盒，通过RACE技术，进一步克隆获得HcGAPDH 基因全长cDNA 序列。将两端带有EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点HcGAPDH 基因的开放阅读框（ORF）片段连接至pEGAD 双元载体，最终产生HcGAPDHGFP 融合片段。将测序正确的载体转化至农杆菌GV3101，并通过真空渗透法转化拟南芥［20］。所获得种子在含有50μg／mL Basta的培养基上进行筛选，最终获得pEGAD／HcGAPDH 转基因阳性拟南芥。所用引物见表1。

1．4 绿色荧光蛋白检测

将上述的pEGAD／HcGAPDH 转基因阳性拟南芥植株，在含有抗生素的培养基上培育7d后，挑取阳性植株置于含3%葡萄糖的MS培养基处理12 h后，放置载玻片上，用荧光共聚焦显微镜观测。图像由FV10－ASW 1．7A 软件（Olympus Corp．，http：／／www．olympusamerica．com／）处理。

表1 引物序列表Table 1 Table of primer pairs

2 结果与分析

2．1 HcGAPDH 的序列分析

根据抑制差减文库中分离的基因EST 序列［8］，通过RACE技术克隆获得1 381bp的HcGAPDH全长cDNA 序列，其ORF 编码314个氨基酸。利用Clustalw 序 列 比 对 软 件（http：／／www．ebi．ac．uk／Tools／msa／clustalw2／）预测该基因氨基酸序列与已报告的GADPH 家族成员具有高度保守性，故将该基因命名为HcGAPDH（图1，A）。根据蛋白质结构 域 在 线 分 析 软 件（http：／／myhits．isb－sib．ch／cgi－bin motif＿scan）结果，发现HcGAPDH 具有2个不同的结构域：位于N 端包含有烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD＋）结合位点的结构域（4～154）；位于C 端包含有2 个甘油醛－3－磷酸（Glyceraldehyde 3－phosphate）结合位点的结构域（156～314），这2个结构域均与GAPDH 作为水解酶的活性具有相关性（图1，B）。因此，本实验所克隆的HcGAPDH可被认为是GAPDH 基因家族成员之一。

2．2 HcGAPDH 在盐胁迫和ABA 处理下的表达

图1 HcGAPDH 与其他物种GAPDH 蛋白序列比对（A）及其保守结构域分析（B）Fig．1 Alignment of full－length deduced amino acid sequences of HcGAPDH and GAPDH orthologues from different phylogenetic origins（A）and the structure of the conserved regions（B）of HcGAPDH protein．

为研究HcGAPDH 表达是否受盐胁迫和植物抗逆激素ABA的影响，通过实时定量RT－PCR技术，检测4周龄盐穗木在盐胁迫和激素ABA 处理下Hc－GAPDH 的表达。结果表明，内参基因HcRd22［17］的基因表达量随着盐胁迫或ABA 处理时间的延长呈上调趋 势（图2）。在ABA 胁 迫 处 理3 和6h 时，HcRd22转录水平有下降趋势，但与对照组相比差异不显著；在ABA 胁迫处理12h时，HcRd22表达量达到最大值，且与对照组相比差异显著。相比之下，HcGAPDH 表达在盐胁迫6h时达到最高峰，随后降低。50μmol／L ABA处理使得HcGAPDH 表达在胁迫12h内呈现逐渐上升趋势，在12h时达到最高值（图2）。总之，这些结果表明HcGAPDH 基因的转录水平受盐胁迫和ABA 处理调节。

图2 盐胁迫（A）和ABA（B）处理下HcGAPDH 表达＊和＊＊分别表示0．05和0．01水平显著性差异Fig．2 qPCR analysis of the expression of HcGAPDH with NaCl（A）or ABA（B）treatments＊and＊＊ mean significant differences at 0．05and 0．01levels，respectively．

图3 盐胁迫下HcGAPDH 在转基因植株根部组织的亚细胞定位Fig．3 Subcellular－localization of HcGAPDH in the root of transgenic seedlings under salt stress

图4 糖缺乏下HcGAPDH 在转基因植株根部组织细胞的亚细胞定位Fig．4 Subcellular－localization of HcGAPDH in the root of transgenic seedlings under sugar starvation

2．3 盐胁迫下HcGAPDH 的亚细胞定位

动物GAPDH 在不同生理状况下具有不同亚细胞定位［3，5］。为检测HcGAPDH 在盐胁迫下是否具有亚细胞定位的改变，将在MS 培养基生长7d的HcGAPDH－GFP 和GFP 转 基 因 植 株，分 别 用200mmol／L NaCl处理24h后，进行GFP 荧光观测（图3）。结果显示，在正常生长状况下，GFP－Hc－GAPDH 蛋白荧光信号主要集中在转基因植株根部细胞的细胞质中。当用200mmol／L NaCl处理12 h后，对照组GFP 蛋白主要分布于细胞周质中，而GFP－HcGAPDH 蛋白则明显地聚集在转基因细胞的细胞核中，而在细胞质分布较少，表明盐胁迫可促使HcGAPDH 蛋白在植物细胞核中富集。

2．4 HcGAPDH 由细胞质转移至细胞核中不依赖于碳水化合物介导的信号反馈通路

为检测碳水化合物的匮乏是否是盐胁迫下植物GAPDH 改变亚细胞定位至细胞核的诱因之一，将7d大的HcGAPDH－GFP 转基因植株置于有3%葡萄糖的MS培养基上处理12h后，在共聚焦显微镜下观测其亚细胞定位。结果（图4）显示，与含有葡萄糖的培养基上生长的幼苗相比，在糖缺乏培养基上幼苗的GFP荧光信号明显下降，而且荧光信号仍集中分布于细胞质中，在细胞核上没有发现明显的荧光信号累积。这些结果暗示了糖信号介导Hc－GAPDH 蛋白自身的周期控制，该过程不同于盐胁迫应答过程的HcGAPDH 亚细胞定位改变。

3 讨 论

GAPDH 作为糖酵解途径中的一种关键酶之一，长期以来被认为是在同种细胞或组织中恒定表达且只存在于细胞质中的管家基因产物。然而最近研究表明在动物细胞中，GAPDH 的mRNA 和蛋白质水平会随着各种环境因素的影响而发生变化［4，21］，且可以定位于除细胞质之外的质膜、细胞核、多聚体、内质网与高尔基体上［22－25］。而在植物细胞中，盐胁迫处理的盐生植物西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum）中PsGAPDH 也发现同样的上调表达［26］。在本研究中，盐胁迫和ABA 处理同样也可诱导盐生植物盐穗木HcGAPDH 的基因表达上调。此外，镉胁迫［13］处理可诱导拟南芥AtGAPDH蛋白定位于细胞核，而在本研究中发现了盐胁迫也可促使HcGAPDH 在转基因植株根部细胞中由细胞质转移至细胞核，暗示了逆境胁迫下不同生物体内（主要是动物和植物细胞内）的GAPDH 也许具有相似的生理功能。

糖酵解是动植物以及微生物细胞中葡萄糖分解产生能量的共同代谢途径。研究表明糖酵解过程中产生的能量和一些代谢物质可用于其它生物反应过程，这对植物在逆境中的存活至关重要［9，10］。人源HsGAPDH 已被证实通过与核转录复合物Oct－1－OCA－S结合将细胞内的代谢平衡与细胞核中组蛋白的转录和DNA 复制结合在一起［3］。因此，提出植物GAPDH 作为糖酵解中酶类物质之一，也可通过作为细胞内代谢状况的感应元件参与植物盐胁迫应答这一假说。然而在糖饥饿的转基因植物细胞中，HcGAPDH－GFP融合蛋白并没有在细胞核处发生明显的荧光信号聚集现象，而是HcGAPDH－GFP融合蛋白的荧光信号明显降低，本研究结果与Cotelle等［27］报道相一致，糖饥饿促使糖酵解相关酶蛋白发生降解。同时，这一结果也暗示了碳水化合物水平的改变并不是盐胁迫下GAPDH 功能发生改变的原因，但这仍需要进一步实验验证。在动物体系 中，GAPDH 的 细 胞 核 定 位 与 基 因 转 录［5，28］具 有相关性，但这尚未在植物中有相关报道。因此植物GAPDH 通过胞内定位的改变对植物抗逆能力的影响机制还有待于进一步探讨。

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