甜瓜果实糖含量相关性状QTL分析

张 宁，张 显＊，张 勇，马建祥，杨小振，王永琦，2

（1 西北农林科技大学 园艺学院／农业部西北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，陕西杨陵712100；2 汉中农业技术推广中心，陕西汉中723000）

甜瓜（CucumismeloL．）是黄瓜属（Cucumis）作物，是广泛种植的水果型蔬菜。随着生活水平的不断提高，消费者对甜瓜果实品质的要求也日益提高，因此改善甜瓜营养品质是当前甜瓜品质育种的重要内容。甜瓜果实中含糖量是影响其品质成分的重要因子。甜瓜果实中可溶性糖主要包括葡萄糖、果糖和蔗糖［1］，已有研究表明糖类的甜度由高到低依次为果糖、蔗糖和葡萄糖［2］。因此开展甜瓜果实糖含量相关性状的遗传改良对改善果实营养品质具有重要意义。

随着分子生物学技术的不断发展，遗传连锁图谱的出现为瓜类作物果实糖含量相关性状的遗传改良研究提供了有力的工具。目前国内外研究者已开展了瓜类作物果实糖含量QTL 定位研究。Burger等［3］对西瓜糖含量性状的遗传效应研究结果表明高糖含量由单隐性基因控制。Paris等［4］对不同环境条件下甜瓜果实可溶性固形物含量进行了QTL 定位，在2种环境中均检测到与可溶性固形物含量相关的2 个QTL 位点，分别为Ssc7．4 和Ssc10．8；Monforte等［5］利用F2群体和DH 系群体对甜瓜果实糖分进行了QTL 定位，检测到与果实糖分相关的5个QTL位点。郭少贵等［6］对不同环境条件下西瓜果实可溶性固形物含量进行QTL 定位，分析认为位于第1连锁群上的2个位点可能是控制西瓜可溶性固形物含量的主效基因位点。刘识等［7］通过构建西瓜F2群体对果实中心糖和边糖含量进行QTL定位，检测到与中心糖含量相关的QTL 为Tmsc3．1，贡献率为6．56%；边糖含量相关的QTL为Tesc12．1，贡献率为7．90。然而有关利用甜瓜远缘群体构建的遗传图谱对果实糖含量相关性状进行QTL定位方面的研究尚未见报道。本研究以糖含量差异较大的甜瓜品系0246与野生种质Y101杂交获得的F2代群体为试验材料，基于SSR 标记技术构建甜瓜遗传连锁图谱，分析与果实糖含量相关性状紧密连锁的QTL 位点，以期为甜瓜果实糖含量相关基因的精细定位及克隆奠定基础。

1 材料和方法

1．1 试验材料

亲本材料为栽培厚皮甜瓜0246（P1）和野生薄皮甜瓜Y101（P2），双亲糖含量相关性状差异显著，其中P1和P2都是经过多代自交选育的自交系。以双亲配制的包含135个单株的F2代群体为试验材料。试验材料由西北农林科技大学园艺学院西瓜甜瓜课题组提供。

1．2 试验方法

1．2．1 群体构建及田间试验设计 2011年春季双亲杂交获得F1代种子。2012年春季将F1代自交，获得F2代种子。2013年春季将试验材料种植于大棚内，其中P1、P2、F1代各种植30株，每个小区种植10株，3 次重复；随机种植F2代135 株。株距35 cm，行距75cm，吊蔓栽培，单蔓整枝，第13～15节子蔓留单果，按常规栽培管理进行。

1．2．2 糖含量的测定 果实收获后，取每个果实的边部直到中心的果肉混合，称取每份5g，重复3次，放于－80℃冰箱中保存。果实糖含量待测液提取参照万学闪等［8］的方法，略有改动：取5g冻样加入6mL 80%乙醇溶液，混匀后放于80℃水浴锅中浸提40min，10 000r／min离心20min，吸取上清液，并将残渣重复上述操作合并上清液，定容至25mL待用。果糖和蔗糖含量采用蒽酮比色法测定［9］，还原糖含量采用3，5－二硝基水杨酸比色法测定［10］，测定的还原糖含量数值减去果糖含量数值即为葡萄糖含量数值，果糖、葡萄糖和蔗糖含量数据的和即为总糖含量［11］，重复3次，取平均值。

果糖含量（g／kg）＝（0．178A＋0．00018）×f

还原糖含量（g／kg）＝（0．6A＋0．0078）×f

蔗糖含量（g／kg）＝（0．04A－0．0004）×f

式中，A为吸光值；f为稀释倍数，以鲜重计。

1．2．3 SSR 引物来源 2013年春季，苗期采集母本、父本、F1、F2单株茎间嫩叶2g，采用改良CTAB法提取甜瓜基因组DNA［12］。试验用的SSR 引物序列来自已公开发表文献［13－25］及互联网葫芦科作物EST 数 据 库（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／dbEST；http：／／www．icugi．org／），共计506 对，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。甜瓜SSR－PCR反应体系及程序参照乔军等［26］方法，略有改动。SSR 扩增产物用9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，对结果进行记录。

1．2．4 QTL分析 利用Microsoft Excel 2010软件对分子试验数据进行统计。将符合分离比（1∶2∶1）的标记利用Joinmap 4．0软件构建遗传连锁图谱。选择QTL IciMapping V3．2软件进行QTL分析。采用完备区间作图（ICIM）法对果实糖含量相关性状进行QTL 定位，LOD 阈值设定为3．0，以1cM 为步进区间对全基因组进行QTL 扫描，并进行1 000次置换检测。

2 结果与分析

2．1 糖含量相关性状遗传分析

由表1 可知，母本与父本果糖含量分别为16．326和3．559g／kg，葡萄糖含量分别为12．462和2．420g／kg，蔗糖含量分别为50．045 和2．538 g／kg，总糖含量分别为78．770 和8．517g／kg。利用DPS V7．05软件对亲本间糖含量性状进行显著性分析，表明双亲糖含量性状差异极显著，数据可用于QTL分析。F2代群体果糖、葡萄糖、蔗糖和总糖含量性状多数均介于双亲之间且分离明显，表现多峰分布，峰度及偏度均小于1，由此可知属于典型的数量性状遗传。

2．2 多态性引物的筛选

利用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计对提取的双亲、F1及F2基因组DNA 进行检测，结果表明其浓度和质量均适用于SSR 扩增。选择506对SSR 引物对双亲进行多态性扩增，共筛选出具有多态性且稳定遗传的SSR 引物67 对，多态率为13．24%。

2．3 遗传连锁图谱的构建

利用筛选出具有多态性的SSR 引物67对，并对F2远缘群体135个单株DNA 进行多态性扩增，然后再进行卡方检测。结果表明在67个标记中有58个标记符合理论分离比（1∶2∶1），其余9个标记表现出不同程度的偏分离现象。SSR 标记在F2群体部分单株中的扩增带型如图1。

采用Joinmap 4．0 软件对筛选出的58 个标记进行遗传连锁图谱的构建，得到一张包含有14个连锁群的遗传连锁图谱。58个标记分属于14个连锁群，覆盖基因组长度为726．30cM，相邻标记间距离为12．74cM，各连锁群的标记数为2～10，长度为18．1～118．0cM。标记最多的第8连锁群，分布10个标记，标记间平均距离为13．10cM，标记最少的分别为第7、10、14连锁群，只分布了2个标记。平均遗传距离最大的为第13连锁群，平均遗传距离为30．70cM，平均遗传距离最小的连锁群为第13 连锁群，平均遗传距离为9．00cM（表2）。

表1 亲本及F2 群体果实糖含量相关性状遗传分析Table 1 Genetic analysis of fruit sugar content correlated traits in two parents and F2population

2．4 糖含量相关性状的QTL分析

依据得到的甜瓜遗传连锁图谱和果实糖含量相关性状的表型数据，运用QTL IciMapping V3．2软件对果实糖含量相关性状进行QTL 扫描分析。结果表明，在第3和第4连锁群（LG3、LG4）上检测到2个分别与总糖含量和果糖含量相关的QTL（图2）。QTL的命名是以性状的英文缩写、连锁群号以及QTL编号为依据。

将与果糖含量和总糖含量相关的QTL 位点分别命名为Fru4．1和Ts3．1。由表3中可知，Fru4．1位点位于第4连锁群CMAGN73－CMTC168标记区间，与标记CMAGN73的遗传距离为16．0cM。该位点加性效应值为0．40，加性效应为正值，对增加果糖含量表现为增效累加效应。可解释表型变异的13．02%。Ts3．1 位点位于第3 连锁群CMCTN5－TJ10标记区间，与标记TJ10 的遗传距离为12．6 cM。该位点加性效应值为9．26，加性效应为正值，对增加总糖含量表现为增效累加效应。可解释表型变异的14．89%。

表2 甜瓜连锁遗传图谱的基本参数Table 2 Description of the linkage groups in melon

图1 SSR 标记在F2 群体中PCR 扩增的部分带型Fig．1 PCR profiles generated by SSR in part of F2population

图2 甜瓜遗传连锁图谱构建及果糖和总糖含量相关QTL分析Fig．2 The construction of genetic linkage map and analysis of QTLs associated with fructose and total sugar contents in melon

表3 甜瓜果糖和总糖含量相关的QTLTable 3 QTLs associated with fructose and total sugar contents in melon

3 讨 论

偏分离是植物构建遗传连锁图谱研究中的一种非常普遍的现象，能够提高群体内杂合基因型的频率。研究者普遍关注偏分离现象的原因，主要是因为其具有一种非常重要的进化原动力［27］。刘莉等［28］采用西瓜F2群体，基于AFLP 标记构建遗传连锁图谱，偏分离率为27%；朱子成等［29］采用甜瓜重组自交系，基于SSR 标记构建遗传连锁图谱，偏分离率为7．98%；张雪娇等［30］采用甜瓜重组自交系，基于SSR 标记构建遗传连锁图谱，偏分离率为9．33%；王兆吉等［31］采用西瓜F2群体，基于SSR 标记构建遗传连锁图谱，偏分离率为18．18%。本研究采用甜瓜F2群体，基于SSR 标记构建遗传连锁图谱，偏分离率为13．43%。由此可见，不同的试验材料及构图群体可能会导致不同程度的偏分离现象。本研究偏分离率较高，可能是由于所选用的作图群体较小，导致标记表现出偏分离现象。

SSR 标记具有覆盖基因组范围广、共显性和可重复性好等特点而不仅被广泛应用于瓜类遗传连图谱的构建工作中，还被应用于构建高密度遗传连锁图谱。谭行之等［32］利用SSR 和AFLP标记构建了一张包括12个连锁群和84个标记位点的南瓜遗传连锁图谱。本研究利用SSR 标记构建了一张包括14个连锁群和58个标记的遗传连锁图谱。覆盖基因组长度为726．30cM，标记间平均图距为12．74 cM。此外，在LG2、LG3、LG4、LG5、LG11、LG12连锁群上标记间遗传距离较大，表明这些部位的标记空缺较多，可能是由于作图群体数量较小，导致了标记间交换值估计的偏差。在以后的研究中，需增加作图群体数量来获得标记间遗传距离较小的遗传图谱。

Harel－Beja等［22］对甜瓜果实糖含量性状进行QTL定位发现了与蔗糖含量相关的6 个QTL 位点，遗传效应以加性为主，同时还将与果糖含量相关的1个QTL 位点定位到第4 连锁群。Soon等［33］对甜瓜果实糖含量性状进行QTL 定位，结果表明与蔗糖含量相关的6个QTL 位点遗传效应以加性为主。这与本试验的结果一致。本研究共检测到与果糖和总糖含量相关的2 个QTL 位点，且均为加性遗传效应，分别对增加果糖和总糖含量效应表现出增效累加性。其中将与果糖含量相关的1个位点定位于第4连锁群，可解释表型变异的13．02%；将与总糖含量相关的1个位点定位于第3连锁群，可解释表型变异的14．89%。已有研究表明贡献率低于5%可视为微效QTL，贡献率高于15%可视为主效QTL［34］。本研究中与总糖含量相关的QTL 位点贡献率为14．89%，接近于15%，可视为主效QTL。然而糖分含量符合典型数量性状遗传特征，比较容易受到环境条件的影响。因此本研究检测到的2个QTL 位点需进一步利用永久性群体进行重复的验证，以期为甜瓜果实糖含量相关基因的精细定位提供理论依据，进而为甜瓜果实品质的遗传改良奠定基础。

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