聚凝胺增强Ror2重组腺病毒感染K562细胞效应的研究

高爱君，司维柯，赵宸，吴韦铷

聚凝胺增强Ror2重组腺病毒感染K562细胞效应的研究

高爱君，司维柯，赵宸，吴韦铷

目的探索应用聚凝胺(polybrene)试剂增强Ror2重组腺病毒对K562细胞转染效率的技术。方法在K562细胞中分别加入0～12μl Ror2重组腺病毒，摸索最佳重组腺病毒用量；同时加入0～5μg/ml polybrene和最佳重组腺病毒用量，培养1～3d后，在荧光显微镜下计数，对比加入polybrene前后被感染的细胞数。台盼蓝染色观察重组腺病毒引起K562细胞死亡的情况。采用RT-PCR和Western blotting检测Ror2基因的表达情况。结果Polybrene浓度为3μg/ml和重组腺病毒8μl时，感染效果最佳，对细胞生长影响较小，实验组感染效果是对照组的17倍；加入polybrene后，外源性Ror2 mRNA和蛋白表达水平均明显增高。结论Polybrene能显著增强重组腺病毒感染K562细胞的作用，并能高效表达外源性Ror2基因，该法简便、价廉、有效，是血液疾病分子生物学研究的一个良好策略。

聚凝胺；腺病毒科；K562细胞；基因，ror2

我们的前期研究发现，在慢性粒细胞白血病细胞株K562中，Ror2可能是一种白血病抑制受体，但它在K562细胞中发挥的作用及具体机制尚不明确[1]，目前国内外也未见相应报道。要开展这方面的研究，首先需要将Ror2基因导入K562细胞。目前导入基因的方法主要有生物学方法、化学方法和物理方法。相比之下，生物学方法对细胞损伤小，导入效率高，被广泛采用。生物学方法通常采用病毒作为基因载体，如反转录病毒、慢病毒和腺病毒载体。慢病毒和反转录病毒导入的基因可整合到细胞的基因组序列中，所以有潜在致病风险，且导入细胞的拷贝数不高，基因表达变化不明显，且不易感染终末期或增殖慢的细胞，制备也相对烦琐。腺病毒载体因相对稳定，感染滴度较高，能转染非增殖细胞，成为广泛使用的转基因工具。但在实际应用中，我们发现对一些悬浮细胞(如白血病细胞)，它的感染率较低。

多聚阳离子聚合物1,5-二甲基-1,5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物(polybrene)可作为辅助试剂中和细胞和病毒颗粒表面的唾液酸，消除静电排斥，促进两者间的相互作用，从而提高重组腺病毒的感染效率。本文探讨polybrene的最佳用量，与病毒的最佳配比剂量以及作用时间，使其能增强Ror2重组腺病毒感染K562细胞的效率，且不影响细胞生长状态，而且导入Ror2的基因可高效表达具有生物活性的Ror2蛋白，旨在为Ror2与白血病发生关系及其机制的研究奠定基础，为血液疾病的基因研究提供价廉物美、简便快速的技术和方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 DMEM高糖培养基、胎牛血清(美国Hyclone公司)，Tripure试剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)，PCR试剂盒(美国Roche公司)，Ror2抗体(美国Cell Signaling公司)，HRP标记羊抗兔lgG、HRP标记羊抗鼠IgG(北京中杉金桥生物技术公司)，增强化学发光显色试剂盒(美国Invitrogen公司)，DMSO、polybrene(美国Sigma公司)。polybrene工作液(1mg/ml)配制：0.1g polybrene溶解于100ml PBS溶液中，充分混匀，置于–20℃保存备用。

1.2 重组腺病毒和细胞来源 重组Ror2腺病毒由美国芝加哥大学医学中心，分子肿瘤研究室何通川教授惠赠。K562细胞来自本实验室保存，置于含5% CO2、37℃的培养箱中培养。

1.3 重组腺病毒最佳用量的细胞实验 在24孔板中加入1ml DMEM高糖培养基和1×105个培养状态良好的K562细胞悬液，分别加入0～12μl的重组Ror2腺病毒，培养2d后，荧光倒置显微镜下计数5个高倍视野(5HP)中被感染的细胞数；并加入0.4%台盼蓝100μl，使台盼蓝终浓度为0.04%，立即于牛鲍氏计数板中计数，3min内完成，显微镜下着蓝色的细胞数即为死亡细胞数(个/ml)。每次实验重复3次，每组设3个复孔，取平均值。分别以荧光细胞数(个/5HP) 为纵坐标，重组腺病毒用量(μl)作为横坐标作图；以死亡细胞数作为纵坐标，腺病毒用量(μl)作为横坐标作图。最佳重组腺病毒用量定义为：荧光细胞数最多、细胞死亡数最少所对应的病毒用量。

1.4 Polybrene最佳浓度的确定 在6孔板中分别加入3ml DMEM高糖培养基和1×105个生长状态良好的K562细胞悬液，加入前述实验确定的最佳重组Ror2腺病毒用量，再分别加入1mg/ml polybrene工作液0～15μl，使终浓度为0～5μg/ml，每组需设3个复孔，培养2d后，分别计数5个高倍视野下被感染的细胞总数(个/5HP)，每个实验需重复3次，取平均值。以荧光细胞数对polybrene最佳浓度(μg/ml)作坐标图。以荧光细胞数最多所对应的polybrene终浓度为最佳浓度。

1.5 Polybrene最佳作用时间的确定 在6孔板中分别加入3ml DMEM高糖培养基和1×105个生长状态良好的K562细胞悬液，加入以上实验确定的最佳重组Ror2腺病毒用量和最佳polybrene用量作为实验组，只加入最佳重组Ror2腺病毒用量作为对照组，培养1～3d后，分别计数5个高倍视野下被感染的细胞总数(个/5HP)，每个实验需重复3次，取平均值。以荧光细胞数对polybrene最佳作用时间(d)做坐标图。以荧光细胞数最多所对应时间为最佳作用时间。

1.6 外源性Ror2基因表达的鉴定

1.6.1 RT-PCR检测K562细胞中Ror2 mRNA的表达联用polybrene和重组腺病毒作为实验组，单用Ror2重组腺病毒作为对照组，分别感染细胞2d后，RT-PCR检测K562细胞中采用Tripure RNA 分离试剂提取细胞总RNA，测定RNA 的A260/A280值并计算浓度，参照RT-PCR试剂盒说明书加入1μg总RNA，建立20μl RT反应体系。PCR反应体系25μl，Ror2上游引物：5'-CTCATGATCGAGTGCTGGAA-3'，下物引物：5'-CGTTGCTCACATTGCTCACT-3'，扩增产物274bp；GAPDH上游引物：5'-CATCACCATCTTCC AGGAGCG-3'，下游引物：5'-TGACCTTGCCCACAG CCTTG-3'，扩增产物443bp。扩增条件：94℃ 预变性5min；94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s，共循环38次；72℃ 延伸7min，最后取20μl扩增产物于1.6%琼脂凝胶电泳并照相和图像处理。

1.6.2 Western blotting检测Ror2蛋白的表达 将联用polybrene和重组腺病毒处理作为实验组，单用Ror2重组腺病毒作为对照组。感染细胞2d后，加入总蛋白裂解液(RIPA裂解液)，冰上裂解30min，4℃，12 000×g离心10min，收集上清，用BCA法测量蛋白浓度。将定量后的蛋白以每个上样孔50μg上样，于10%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离，半干法电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭液封闭，室温封闭1h，TBST 洗膜后，加1:1000稀释的Ror2一抗，4℃摇床孵育过夜，TBST洗去一抗后，加入1:2000稀释的HRP标记山羊抗兔二抗，室温摇床孵育1～2h，TBST洗膜后，用增强型化学发光试剂显色，凝胶成像仪暗室显影。

1.7 统计学处理 采用SPSS 19.0软件进行分析，两样本间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 重组腺病毒最佳用量的确定 每孔加入2～8μl重组腺病毒时，随着用量的增加， 荧光细胞数逐渐增多，当加入8μl时，与不加重组腺病毒的对照组相比明显增多(P<0.05)；与8μl组相比，加入10μl组差异无统计学意义(P>0.05)；当大于10μl时，荧光细胞数明显降低，因此8μl重组腺病毒感染细胞最多(图1)。台盼蓝染色结果显示：重组腺病毒用量为1～8μl时均未引起细胞死亡，但9μl以上的浓度可使细胞死亡数目明显增加，达1×104(个/ml)，与不加重组腺病毒的对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，提示病毒用量不宜大于8μl(图2)。最终结果表明：8μl为重组腺病毒的最佳用量，此时感染细胞最多，且无细胞死亡。

图1 重组腺病毒最佳用量确定(荧光显微镜)Fig. 1 The optimal dosage of recombinant adenovirus infection (Fluorescence microscopy)(1)P<0.05 compared with control group without recombinant adenovirus

图2 重组腺病毒对细胞死亡的影响(台盼蓝染色法)Fig. 2 Effect of recombinant adenovirus on cell death (Trypan blue staining)(1)P<0.05 compared with control group without recombinant adenovirus

2.2 增强重组腺病毒感染K 5 6 2细胞的最佳polybrene作用浓度 未加polybrene的重组腺病毒感染效率较低，加入polybrene，被感染细胞明显增多(图3)。随着polybrene浓度增加，感染细胞数逐渐增加。当polybrene终浓度增加到3μg/ml后，感染细胞数达260个/5HP，是polybrene对照组(15个/5HP)的17倍(P<0.01)，是polybrene处理组(2μg/ml)的1.2倍(P<0.05)。而polybrene浓度增加到4μg/ml时，感染细胞数略有下降，但差异无统计学意义(P>0.05，图4)。

图3 Polybrene 增强重组腺病毒感染K562细胞(×200)Fig. 3 The infection efficiency of recombinant adenovirus was enhanced by polybrene (×200)The morphology of K562 cells treated without polybrene under fluorescence microscope(A,B) and those with polybrene (C,D)

图4 Polybrene增强重组腺病毒感染的最适浓度Fig. 4 The optimal concentration of polybrene that enhances the infection efficiency of recombinant adenovirus(1)P<0.01 compared with the control group without polybrene; (2)P<0.05 compared with 2μg/ml polybrene treated group

2.3 Polybrene增强重组腺病毒感染K562细胞最佳作用时间的确定 polybrene作用第1天，感染细胞数为260个/5HP，第2天为325个/5HP，第2天感染细胞数是第1天的1.25倍(P<0.05)。第3天感染细胞数下降为62个/5HP，第2天感染细胞数目是第3天的5.24倍(P<0.05，图5)。所以选择polybrene感染2d作为最佳作用时间。

2.4 Polybrene增强重组腺病毒导入Ror2基因mRNA及蛋白表达检测 最佳polybrene终浓度为3μg/ml和最佳的腺病毒8μl感染K562细胞2d后，分别提取Ror2的mRNA和蛋白行RT-PCR和Western blotting检测，结果显示，与对照组相比，实验组Ror2 的mRNA和蛋白表达水平均明显增加(图6)。

3 讨 论

Ror2是受体酪氨酸激酶样孤儿受体2，属于Ⅰ型受体酪氨酸激酶(RTK)家族成员，是一类膜受体，它在多种肿瘤中的作用已有报道，如在骨肉瘤[2]、肾细胞癌[3]、黑色素瘤[3-4]中高表达，其作用类似癌基因。而在部分肿瘤中，Ror2却具有抑癌作用，如在鼻咽癌、胃癌[4]、肝癌[5]中表达下调。Ror2在白血病中的研究尚不清楚。本课题组前期研究发现，Wnt5a是一种白血病抑制因子[6-7]，它可上调Ror2，且可优势性结合Ror2受体而不是LRP6受体，进而转导Wnt5a/Ror2非经典信号通路，抑制Wnt/β-catenin通路(即Wnt经典通路)，从而发挥抑癌作用[8]。近来报道认为，Wnt5a发挥何种生物学功能，如抑癌或促癌，与其结合何种受体有关，即所谓的受体途径，与细胞类型有关。本课题组的预实验还发现过表达外源性Ror2比过表达Wnt5a有更强的抑制K562细胞增殖作用，如前者诱导细胞凋亡，而后者没有凋亡发生。这个问题引发了研究“Ror2与白血病关系”的兴趣，而将Ror2基因导入白血病细胞，制作过表达Ror2白血病细胞模型是研究的关键。导入基因常用的方法有脂质体法、电转法和病毒载体感染法，其中病毒感染法对细胞损伤小、导入基因效率高[9]，故病毒载体是目前应用最广泛的转基因载体，如反转录病毒，慢病毒和重组腺病毒载体，选用何种病毒载体常取决于细胞种类和病毒特性。重组腺病毒载体与反转录和慢病毒相比具有以下优势：①宿主范围广，对人致病性低；②在增殖与非增殖细胞中均可感染和表达基因；③能有效地增殖并且滴度高，且能在悬浮培养液中扩增；④与人类基因同源性高；⑤不整合到染色体中，无插入致突变风险，安全性较好。基于以上优点，我们选择了重组腺病毒转基因技术。实验为解决病毒感染血液细胞效率不高这一血液肿瘤研究领域共同面临的技术难题[10-11]，我们曾用反转录病毒制作稳定表达Ror2的K562细胞株，但细胞株增殖减慢甚至难以存活。

图5 Polybrene增强重组腺病毒感染的最佳时间Fig. 5 The optimal time of recombinant adenovirus infection enhanced by polybrene(1)P<0.05 compared with the first day; (2)P<0.05 compared with the third day

图6 polybrene增强Ror2 mRNA和蛋白水平的表达Fig. 6 mRNA and protein expression of Ror2 was enhanced by polybreneA. RT-PCR; B. Western blotting; 1. Polybrene(+); 2. Polybrene(-)

Polybrene是一种多聚阳离子聚合物，最早应用在交叉配血中，因为其可中和红细胞表面唾液酸所带的负电荷，使红细胞表面Zeta电位降低，细胞易发生凝集，减少了交叉配血假阳性，有助于避免输血反应的发生[12]。有报道认为病毒颗粒和被感染细胞表面带有相同的负电荷，排斥作用使病毒难导入基因[13]。采用polybrene中和细胞表面和病毒颗粒上唾液酸的电荷，消除排斥作用，即可增强病毒的转染效率[14-18]。本课题组曾采用polybrene辅助重组腺病毒感染间充质干细胞，大大提高了转入外源性基因的效率，简便而高效地开展了骨再生分子生物学方面的研究[15]。本研究将该技术应用于难转染的血液细胞，在血液疾病分子生物学研究领域具有更重要的应用价值。

本课题探讨了polybrene作为辅助试剂，增强Ror2重组腺病毒感染K562细胞的作用，并摸索了它与重组腺病毒的最佳搭配浓度，最佳作用时间以及对细胞死亡的影响，并检测导入目的基因Ror2在mRNA和蛋白表达水平的变化。研究结果表明，8μl重组腺病毒和 3μg/ml polybrene浓度，对于1×105个K562细胞是最佳的用量和最佳的组合，最佳作用时间是2d。应用polybrene后，感染细胞数是对照的17倍，表明polybrene明显促进了重组腺病毒感染细胞的效率，且在一定的浓度范围内有剂量依赖性。3μg/ml polybrene是辅助重组腺病毒感染细胞的最佳、最安全的剂量。采用RT-PCR和Western blotting分别检测了在最佳重组腺病毒用量、最佳polybrene浓度和最佳感染时间下，Ror2在mRNA和蛋白水平表达均增高，表明polybrene增强了Ror2基因的导入。

综上，polybrene能安全有效地增强重组腺病毒的感染效果，并高效导入目的基因Ror2。polybrene价廉、安全，是一种良好的导入外源性基因的辅助试剂，研究结果较好地解决了白血病细胞等难感染细胞的基因导入难题，为血液肿瘤基因的研究打下了良好的基础。

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Polybrene enhances infection effect of Ror2 recombinant adenovirus on K562 cells

GAO Ai-jun,SI Wei-ke*,ZHAO Chen,WU Wei-ru
Department of Clinical Hematology,Southwest Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400038,China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author,E-mail: weikesi2004@hotmail.com

,E-mail: weikesi2004@hotmail.com
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (81370624)

ObjectiveTo explore a new technique to enhance the efficiency of Ror2 recombinant adenovirus infecting K562 cell line with polybrene.MethodsRecombinant adenovirus Ror2 (AdRor2,0-12μl) was added to K562 cells to look for the optimal dose of recombinant adenovirus. At the same time,polybrene (0-5μg/ml) and optimal dose of recombinant adenovirus were added to K562 cells. The infected cells were counted under fluorescence microscope after they were cultured 1-3 days,and the comparative study was performed between cells treated and not treated by polybrene. The influence of AdRor2 on the death of cells was investigated by trypan blue staining,and the expression of Ror2 gene was assessed with Western blotting and RTPCR.ResultsIt was found that the infection effect was optimal when the concentration of polybrene was 3μg/ml and the recombinant adenovirus was 8μl,and there was little effect on the cell growth. mRNA and protein expression of exogenous Ror2 were significantly elevated.ConclusionsPolybrene can significantly enhance the infection capability of recombinant adenovirus on K562 cells,and it can also effectively express the exogenous Ror2 gene. This technique is simple,inexpensive and effective,thus providing a good strategy for molecular biology research in the field of blood diseases.

polybrene; adenoviridae; K562 cells; genes,ror2

R331.1；R34；R-331

A

0577-7402(2015)12-0976-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.12.08

2015-07-20；

2015-10-27)

(责任编辑：沈宁)

国家自然科学基金面上项目(81370624)

高爱君，硕士研究生。主要从事白血病抑癌基因方面的研究

400038 重庆 第三军医大学西南医院临床血液学教研室(高爱君、司维柯、赵宸、吴韦铷)

司维柯，E-mail：weikesi2004@hotmail.com