体外构建组织工程皮肤修复Ⅲ度烫伤切痂创面的实验研究

2015-06-28马忠锋柴家科杨红明许明火

解放军医学杂志 2015年12期

马忠锋，柴家科，杨红明，许明火

马忠锋，柴家科，杨红明，许明火

目的观察体外构建的组织工程皮肤修复大鼠Ⅲ度烫伤切痂创面的可行性和效果。方法酶消化法获取SD乳鼠表皮细胞和成纤维细胞(Fb)后进行体外培养，同时用高渗盐水/氢氧化钠法制备无细胞毒性猪去细胞真皮基质(PADM)，然后将Fb与Ⅰ型牛胶原混合种植于PADM的表面，以SD乳鼠的第3代表皮细胞种植在真皮基质胶原面获取组织工程皮肤，以SD乳鼠的第3代表皮细胞制备表皮细胞膜片。对48只SD大鼠Ⅲ度烫伤切痂创面分别行组织工程皮肤移植(实验组)和单纯表皮细胞膜片移植(对照组)，术后行大体观察和组织学观察，比较各组创面愈合率、收缩率。抗CD34单克隆抗体免疫组化染色标记血管内皮细胞后行创面微血管计数，抗Laminin免疫组化染色观察基底膜中层黏连蛋白的表达情况。结果两组创面术后均未见对移植物的急性期免疫排斥反应，第2、4、6周实验组移植物成活率分别为75.05%±3.69%、83.12%±3.13%、92.03%±3.87%，与对照组(分别为77.63%±3.23%、83.17%±3.92%、91.09%±3.35%)比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后第2、4、6周实验组移植物收缩率分别为9.13%±2.27%、18.52%±3.40%、23.92%±3.01%，明显低于对照组(分别为14.21%±3.05%、29.12%±3.02%、39.78%±3.42%，P<0.05)。术后6周实验组基底膜结构清晰、连续，对照组基底膜区模糊、不连续。第4、6周后实验组微血管数目分别为37.5±3.9、46.9±3.5个/HP，明显高于对照组(分别为23.0±2.0、27.5±2.7个/HP，P<0.05)。结论以Fb-胶原-PADM活性复合真皮基质为载体，与表皮细胞构建的组织工程皮肤，适用于修复Ⅲ度烫伤切痂创面，能改善创面愈合质量。

组织工程；皮肤，人工；烧伤；伤口愈合

在大面积烧伤患者创面修复中常遇到皮源不足的问题，组织工程皮肤的研究为临床创面修复提供了一条新的途径。本实验在我们以往组织工程皮肤研究[1]的基础上，构建以成纤维细胞(Fb)-胶原-猪去细胞真皮基质(PADM)为载体的乳鼠组织工程皮肤，用其进行大鼠Ⅲ度烫伤切痂创面移植，并与单纯体外培养的表皮细胞膜片创面移植效果进行对比，以期为临床提供一种理想的修复创面及有效改善外观的方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 Dispase-Ⅱ、胰蛋白酶、EDTA、DMEM、胎牛血清、乙酸、Ⅰ型牛胶原、氢氧化钠、氯化钠、兔抗Laminin抗体(美国Sigma公司)，兔抗鼠CD34抗体(美国Santa Cruz公司)。无血清培养基(美国Gibco公司)，培养板(美国Corning公司)。超净台(日本三洋公司，MCO-15AC)、CO2孵箱(日本三洋公司，YD-1320)，离心机(美国SIGMA，1-13)，倒置显微镜(日本Olympus，MT-2)，自制丝网架，水浴恒温振荡器、鼓式取皮刀(上海医疗器械厂)，真空冷冻干燥机(德国Christ公司)，超声波清洗机(瑞典Branson)。

1.2 乳鼠表皮细胞和成纤维细胞的体外培养[2]取SD乳鼠全层皮肤，采用酶消化法获取表皮细胞和成纤维细胞，以无血清培养基进行体外原代、传代培养，取第3代表皮细胞及第10代成纤维细胞用于实验。

1.3 表皮细胞膜片的制备表皮细胞种植于直径60mm培养皿，培养8d后融合为细胞膜片，应用前吸去培养液，以直径60mm的凡士林纱布平铺于细胞融合成片的培养皿底部，加入0.25% Dispase-Ⅱ，在37℃下消化15min后吸去酶液，用PBS洗涤1次，轻轻揭起凡士林纱布，即得到完整的表皮细胞膜片。

1.4 PADM制备取猪断层皮片，按照高渗盐水/氢氧化钠法制备PADM，具体方法参照文献[3]。

1.5 乳鼠组织工程皮肤的制备用手术刀片在组织工程皮肤上刺孔，孔间距约3mm，制备以Fb-胶原-PADM活性真皮基质为载体的乳鼠组织工程皮肤。

1.6 实验动物及分组取健康SD大鼠48只，雌雄不限，体重230～250g。3%戊巴比妥钠50mg/kg腹腔注射麻醉，背部去毛，以100℃水浴12s造成背部直径约3cm大小的Ⅲ度烫伤，切除全层皮肤至深筋膜。创面止血后，将其四角皮肤各缝合一针与肌层固定。随机分为两组(n=24)：实验组采用体外培养的组织工程皮肤植皮，对照组采用单纯表皮细胞膜片植皮。创面移植后用盐水纱布、凡士林纱布及无菌敷料覆盖，打包固定。术后单笼饲养。

1.7 创面愈合情况的大体观察每组分别在术后第2、4、6周各处死8只动物，动态观察创面愈合情况。用数码相机照相，利用图像分析软件(Image-Pro Plus 6.0)分析，计算移植物成活率和收缩率。移植物成活率=移植物成活面积/移植总面积× 100%。移植物收缩率=(移植面积－检测时面积)/移植面积×100%。

1.8 创面组织学观察术后第2、4、6周分别处死的8只动物，取创面组织做以下检查：①活检组织常规制成石蜡切片，HE染色；②兔抗人Laminin抗体免疫组化染色，具体操作按照试剂盒说明进行。

1.9 创面微血管计数对各组第2、4、6周的创面组织标本，采用兔抗鼠CD34单克隆抗体免疫组化染色，标记血管内皮细胞，具体操作按试剂盒说明进行。石蜡切片常规脱蜡及梯度水化，用EDTA抗原修复液进行热修复后，依次加入一抗、二抗进行系列染色。用PBS代替一抗作为阴性对照。染成棕色、孤立的血管内皮细胞或细胞簇视作单个微血管。先在低倍镜下全面观察切片，以确定组织血管密度最高处，再在高倍镜(×200)下随机选择5个视野，计数每个视野所含的微血管数，取其平均值进行统计学处理。

1.10 统计学处理采用SPSS 13.0进行统计分析，数据结果以表示，组间比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 术中情况体外培养的乳鼠组织工程皮肤质地柔软，易于塑型，有良好的弹性和抗拉能力，与创面紧密粘贴，便于手术操作，不容易滑动。

2.2 创面大体观察各实验大鼠清醒后精神状态及进食正常，均可自由活动。术后2周首次打开敷料，各组创面均未见对移植物的急性排斥反应，创面及周围炎症反应不明显。术后2周，实验组创面除边缘有部分裸露，移植的组织工程皮肤大部分质地柔软、色泽红润，创面收缩不明显，皮下无积血、积液，深层的PADM已与肌肉组织之间建立血运且连接紧密；对照组植皮区敷料可见较多液体渗出，创面轻度收缩。术后4周实验组PADM与深层组织结合更加紧密，植皮区移植物收缩不明显，创面基本无液体渗出，愈合不佳处可见肉芽组织；对照组植皮区仍有液体渗出，局部有创面破溃，局部增生明显，移植物可见收缩。术后6周实验组与对照组的创面均基本愈合，皮片有脱屑，无毛发生长，实验组创面柔韧性较好，很容易提捏，创面较光滑、平整，抗摩擦性强，而对照组创面柔韧性较差，不容易提捏，皮肤弹性差，创面可见瘢痕挛缩。

2.3 移植物成活率和创面移植物收缩率实验组术后各时间点移植物成活率与对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05，表1)。对照组移植物可见比较明显的挛缩，皮片薄，抗摩擦性弱，皮肤弹性较差，创面收缩明显，其术后2、4、6周的移植物收缩率均明显高于实验组(P<0.05，表2)。

表1 两组术后创面移植物成活率比较(%，±s)Tab. 1 Comparison of the survival rate of wound graft healing between two groups after operation (%,±s)

Group 2 weeks (n=24) 4 weeks (n=16)6 weeks (n=8) Experiment group 75.05±3.69 83.12±3.13 92.03±3.87 Control group 77.63±3.23 83.17±3.92 91.09±3.35

表2 两组术后创面移植物收缩率比较(%，±s)Tab. 2 Comparison of the rate of wound graft contraction between two groups after operation (%,±s)

(1)P<0.05 compared with control group

Group 2 weeks (n=24) 4 weeks (n=16) 6 weeks (n=8) Experiment group 9.13±2.27(1) 18.52±3.40(1) 23.92±3.01(1)Control group 14.21±3.05 29.12±3.02 39.78±3.42

2.4 组织学检查术后2周两组表皮细胞分化均不明显，真皮层内有大量炎性细胞浸润。术后4周实验组可见表皮结构有分层，细胞分化明显，真皮层内有较多的成纤维细胞，间质可见少许炎性细胞浸润，可见丰富的毛细血管结构垂直于创面生长，而对照组表皮细胞分化仍较差。术后6周实验组皮肤结构较完整，分层接近正常，真皮层内胶原纤维排列规整，可见丰富的毛细血管结构垂直于创面生长，表皮真皮连接区的乳头结构明显。对照组术后6周表皮层较薄，表皮细胞分化程度较实验组差，基底细胞平坦(图1)，真皮内胶原纤维排列疏松紊乱，表皮真皮交界区乳头结构不明显。免疫组化抗Laminin染色显示两组均在基底膜区及真皮血管束周围呈阳性反应，其中实验组基底膜区染色较深，基底膜连续性好，对照组基底膜区染色较淡，基底膜连续性较差(图2)。

2.5 微血管计数术后2周两组微血管计数比较差异无统计学意义(P>0.05)。术后4周实验组微血管生成活跃，术后6周实验组微血管形态和形成过程已接近于正常皮肤，微血管计数数均明显高于对照组(P<0.05，表3)。

图1 两组术后6周移植物组织学观察(HE ×200)Fig. 1 Histological characteristic of the graft in two groups at the 6th week (HE×200) A. Experiment group; B. Control group

图2 两组术后6周基底膜抗Laminin染色结果(×200) Fig. 2 The anti-laminin staining of basement membrane in two groups at the 6th week (×200)A. Experiment group; B. Control group

表3 两组术后创面微血管计数比较(/HP，±s，n=8)Tab. 3 Comparison of the microvessel count between the two groups after operation (/HP,±s,n=8)

(1)P<0.05 compared with control group

Group 2 weeks (n=24) 4 weeks (n=16)6 weeks (n=8) Experiment group 19.1±1.8 37.5±3.9(1) 46.9±3.5(1)Control group 20.4±2.1 23.0±2.0 27.5±2.7

3 讨论

Rheinwald等[4]在1975年报道了较为理想的表皮细胞培养技术，O'Conner等[5]将培养的表皮细胞膜片直接应用于烧伤创面并取得成功。但单纯的表皮替代物存在皮片菲薄，操作困难，移植后创面接受率低，愈合后上皮组织弹性不佳，耐磨性差，后期易发生破溃、瘢痕挛缩严重、组织结构不完整等缺点。Apligraft作为商品化的组织工程全层皮肤，为烧伤患者的治疗带来了一种新的手段，但其费用昂贵，抗胶原酶消化能力弱，抗感染能力差，且应用到创面后降解过快。组织学检测表明，Apligraft应用于人体急性创面后细胞渗透性好，但新生血管形成能力较差，移植4周时创面尚能检测到异体细胞的染色体，但移植6周后已经检测不到异体细胞，Apligraft已经降解。故Apligraft在创面修复过程中仅仅起到临时性的生物材料覆盖作用，目前更多地应用于治疗糖尿病足等慢性溃疡创面的治疗。

1995年Wainwright[6]首先将异体去细胞真皮应用于临床，但异体去细胞真皮存在价格较昂贵、异体皮来源有限、存在传播疾病的风险等缺点。本研究应用组织工程学的方法，在体外培养表皮细胞和成纤维细胞的基础上，将乳大鼠成纤维细胞与胶原凝胶混悬，与PADM构建活性复合真皮基质，进而与乳大鼠表皮细胞构建组织工程皮肤。从结构角度来说，复合真皮基质克服了细胞与单纯PADM黏附性较差的问题，复合真皮基质中的PADM克服了单纯胶原凝胶容易出现收缩的不足。从功能角度来说，胶原凝胶除了为细胞生长提供空间结构以外，对于细胞的生长、分化和迁移也起到重要的调控作用。成纤维细胞分泌的多种生长因子和细胞外基质，可促进表皮细胞的增殖、移动及成熟。

本研究将活性复合真皮基质组织工程皮肤应用到大鼠的深度烧伤创面，经过术后动态观察，未见对移植物的急性排斥反应，组织工程皮肤移植成活率高，与单纯表皮细胞膜片移植比较无显著差异，同时克服了单纯表皮细胞膜片移植后创面收缩严重、愈合后皮肤质量差等方面的不足，提示其是修复深度创面的一种实用方法。另外，抗Laminin染色的结果表明，创面移植6周后组织工程皮肤组移植物有连续、完整的基底膜结构，提示活性复合真皮基质可能有利于基底膜的重建。

在创面愈合过程中，新生血管是创面修复的重要环节。移植物创面修复的再血管化机制相当复杂，涉及细胞、基质和生长因子等综合的调控作用[7]。微血管的数量关系到组织修复的血供，如果创面有相对足够的新生血管形成，创面组织修复能获得充足的营养物质，使创面愈合速度加快[8]。本研究利用CD34单克隆抗体标记创面组织的毛细血管内皮细胞。CD34作为特异性的微血管标记物，其标记显示血管内皮细胞的能力要优于其他标记物。本研究结果显示，组织工程皮肤创面移植后4周微血管计数达到高峰，微血管较丰富，明显高于单纯细胞膜片移植后，表明体外构建的活性真皮基质大鼠组织工程皮肤移植于创面后能迅速建立血液循环，加快血管化进程，使移植物更容易成活，考虑与本实验采用的Fb-胶原-PADM活性复合基质模式有利于细胞因子分泌，具有较高的生物学活性，从而引导各种细胞增殖有关。

本课题组在实验过程中发现成年大鼠表皮和真皮连接紧密，很难用酶消化法获取表皮细胞悬液进行体外培养，故本研究采用乳鼠的表皮细胞进行培养得到组织工程皮肤，整个细胞培养过程的可控性强，但培养过程中要避免成纤维细胞的污染。表皮组织中抗原性较强的细胞是Langhans细胞，而表皮细胞本身的抗原性非常弱，经过培养传代后Langhans细胞可被去除。另外，乳鼠的免疫系统发育不完善，经过数次传代后表皮细胞得以纯化，更进一步降低了其抗原性。本研究过程中术后6周内未观察到受体对移植物的排斥反应。

综上所述，本研究结果表明，以F b-胶原-PADM活性复合真皮基质为载体，与表皮细胞构建的组织工程皮肤，适用于修复Ⅲ度烫伤切痂创面，能改善创面愈合质量。该结果为来源于异体表皮细胞的组织工程皮肤的临床应用提供了实验依据，但有关组织工程复合皮肤的免疫原性、异体表皮细胞远期转归等还需进一步深入研究。

[1]Ma ZF,Chai JK,Yang HM,et al. Experimental study on preparing tissue-engineered skin with substrate of living composite dermal matrix[J]. Chin J Burns,2008,24(4): 272-274.[马忠锋,柴家科,杨红明,等. 以活性复合真皮基质为载体构建组织工程皮肤的研究[J]. 中华烧伤杂志,2008,24(4): 272-274.]

[2]Ma ZF,Chai JK,Yang HM,et al. Establishment of allogenetic epithelial cells and fibroblasts bank[J]. J Hebei Med Univ,2009,30(3): 273-274.[马忠锋,柴家科,杨红明,等. 异体表皮细胞和成纤维细胞库的建立[J]. 河北医科大学学报,2009,30(3): 273-274.]

[3]Ma ZF,Chai JK,Yang HM,et al. Experimental study on preparing PADM without cytotoxicity and microbiological determination and its outcomein vivo[J]. Med J Chin PLA,2009,34(9): 1079-1081.[马忠锋,柴家科,杨红明,等. 无细胞毒性猪去细胞真皮基质制备及转归研究[J]. 解放军医学杂志,2009,34(9): 1079-1081.]

[4]Rheinwald JG,Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells[J]. Cell,1975,6(3): 331-343.

[5]O'Connor NE,Muliken JB,Bank-Schlegel S,et al. Grafting of burns with cultured epithelium prepared from autologous epidermal cells[J]. Lancet,1981,1(8211): 75-78.

[6]Wainwright DJ. Use of an acellular allograft dermal matrix (Alloderm) in the management of full-thickness burns[J]. Burns,1995,21(4): 243-248.

[7]Li L,Lv KY,Wu GS,et al. Advances in research on mechanisms of the effect of negative pressure wound treatment in wound healing[J]. Med J Chin PLA,2014,39(8): 664-668.[李磊,吕开阳,伍国胜,等. 负压创伤治疗促进创面修复的作用机制研究进展[J]. 解放军医学杂志,2014,39(8): 664-668.]

[8]Sun H,Wang X,Hu X,et al. Promotion of angiogenesis by sustained release of rhGM-CSF from heparinized collagen/ chitosan scaffolds[J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2012,100(3): 788-798.

In vitroconstruction of tissue engineered skin for wound repair after escharectomy of third degree scald: An experimental study

MA Zhong-feng1,CHAI Jia-ke2*,YANG Hong-ming2,XU Ming-huo21Department of Surgery,First Hospital of Qinhuangdao,Qinhuangdao,HeBei 066000,China
2Department of Burn and Plastic,Burn Institute of PLA,First Affiliated Hospital of General Hospital of PLA,Beijing 100036,China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author,E-mail: cjk304@126.com

,E-mail: cjk304@126.com

ObjectiveTo observe the practicability and effect of tissue engineered skin for repairing the wound after escharectomy of third degree scald (TDSE) in rat model.MethodsEpithelial cells and fibroblasts from newborn SD rats were isolated by enzyme digestion method and culturedin vitro,and porcine acellular dermal matrix (PADM) without cytotoxicity was prepared by hyperosmotic saline/sodium hydroxide method. The fibroblasts were mixed with bovine type Ⅰ collagen and inoculated on the surface of PADM. Third passage of cultured epidermal cells from newborn SD rats were inoculated on the collagen surface of the dermal matrix to obtain tissue engineered skin,and it was used to prepare epidermal cell sheet. Forty-eight SD rats with TDSE wound were randomly divided into two groups,then tissue engineered skin (experiment group),and epidermal cell sheet (control group) graftings were performed to cover the wounds respectively. Finally,gross observation and histological changes were observed in grafted area. The wound healing rate and wound contraction rate were compared between the two groups. Microvessel count (MVC) was performed with anti-CD34 monoclonal antibody immunohistochemical staining technique,and vascular endothelial cells were labeled. Basal membrane of the skin was identified by immunohistochemical anti-Laminin staining technique.ResultsThere was no obvious sign of acute rejection of the graft in both groups. The graft survival rate was 75.05%±3.69%,83.12%±3.13% and 92.03%±3.87% at the 2th,4th and 6th week respectively in the experimental group. The graft survival rate was 77.63%±3.23%,83.17%±3.92% and 91.09%±3.35% at the 2th,4th and 6th week in the control group. There was no significant difference between the two groups (P>0.05),but the contraction rate of the grafts was 9.13%±2.27%,18.52%±3.40%,23.92%±3.01% at the 2th,4th,6th week,respectively,in the experimental group,and 14.21%±3.05%,29.12%±3.02% and 39.78%±3.42% at the 2th,4th and 6th week in the control group. It was significantly lower than that of the control group (P<0.05). At the 6th post-grafting,the basement membrane was clear and continuous in the experimental group. In contrast,the basement membrane was blurred and discontinuous in the control group. The microvessel count was 37.5±3.9 and 46.9±3.5 per high-power visual field at the 4th and 6th week in the experimental group,and 23.0±2.0 and 27.5±2.7 per high-power visual field at the 4th and 6th week in the control group,and the count was significantly higher in the experimental group than the control group (P<0.05).ConclusionTissue engineered skin prepared by the dermal matrix containing fibroblasts-collagen-PADM combined with epidermal cells is suitable for repairing TDSE wound,and it improves wound healing quality.

tissue engineering; skin,artificial; burns; wound healing

R644

0577-7402(2015)12-0972-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.12.07

2015-05-11；

2015-11-03)

(责任编辑：胡全兵)

马忠锋，医学博士，主任医师。主要从事创面修复材料的研制与应用

066000 河北秦皇岛秦皇岛市第一医院外科(马忠锋)；100036 北京解放军总医院第一附属医院烧伤整形科、全军烧伤研究所(柴家科、杨红明、许明火)

柴家科，E-mail：cjk304@126.com