低剂量电离辐射、一氧化碳、苯和噪声复合作用下大鼠血清的代谢组学研究

王庆蓉，沈先荣，何颖，刘玉明，李珂娴，陈伟，蒋定文，侯登勇

低剂量电离辐射、一氧化碳、苯和噪声复合作用下大鼠血清的代谢组学研究

王庆蓉，沈先荣，何颖，刘玉明，李珂娴，陈伟，蒋定文，侯登勇

目的探讨低剂量电离辐射、一氧化碳、苯和噪声有害环境因素复合作用对大鼠血清代谢产物的影响，探讨复合环境因素导致机体损伤的机制。方法健康成年SD大鼠16只，随机分为正常对照组(不做任何处理)和实验组(每日接受低剂量电离辐射、一氧化碳、苯和噪声的复合作用，共7d)，每组8只。实验结束时腹主动脉取血，分离大鼠血清，采用核磁共振氢谱(1H NMR)仪检测两组大鼠血清样本，得到代谢指纹图谱，采用主成分分析(PCA)和正交信号校正-偏最小二乘(OSC-PLS)法进行模式识别，并通过SIMCA-P软件鉴别两组代谢产物谱的差异。结果大鼠血清1H NMR图谱分析显示对照组和实验组的代谢谱存在明显差异，OSC-PLS分析显示两组代谢产物各自聚集，分布区域明显分开。与对照组比较，实验组血清中脂类、高密度脂蛋白、甘氨酸/葡萄糖、N-乙酰糖蛋白1、N-乙酰糖蛋白2、磷脂酰胆碱和不饱和脂肪酸含量增加，乳酸、苏氨酸/脂质、丙氨酸、肌酸、甘磷酸胆碱/氧化三甲胺、低密度脂蛋白/高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白/低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和饱和脂肪酸含量下降。结论低剂量电离辐射、一氧化碳、苯和噪声有害环境因素复合作用使大鼠血清代谢产物发生变化，主要涉及免疫功能、肾功能和能量代谢。基于核磁共振的代谢组学方法可用于研究多种有害环境因素的复合生物效应，具有较好的应用前景。

辐射损伤；一氧化碳；苯；噪声；代谢组学

某些特殊作业环境中同时存在多种有害理化因素，这些因素复合作用于人体会对健康造成一定影响。动物实验表明，一些复合环境因素产生的生物效应较为复杂，既有拮抗作用，也存在协同作用[1-4]，但上述研究主要集中在动物组织器官病理变化、生理生化指标变化及细胞水平的改变方面，对复合环境因素作用机制的研究尚不够深入。代谢组学技术可通过系统研究代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢的本质[5-6]。机体受到体外因素刺激发生变化的过程中，会影响机体的代谢过程，使机体细胞产生的内源性物质的浓度、种类和比例发生改变，并最终体现为血液、尿液等体液中小分子代谢产物集合轮廓的变化。目前已可采用多种谱学技术建立代谢产物指纹图谱来反映该变化并进一步挖掘谱图的隐含信息，从而使从代谢组学角度阐明复合环境因素影响机体健康的微观本质成为可能。本研究应用基于核磁共振(NMR)技术的代谢组学方法，从小分子代谢产物水平探讨低剂量电离辐射、一氧化碳、苯和噪声有害环境因素复合作用的机制，发现一些小分子代谢产物发生了异常变化，可作为上述环境因素复合作用于机体的生物标志物，为进一步采取有效防护措施提供靶点。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂 美国瓦里安公司(Varian，Inc.)INOVA 600MHz超导核磁共振谱仪，配备脉冲场梯度，带梯度场的三共振探头。离心机(德国Eppendorf MiniSpin Plus)。重水(D2O，美国Cambridge Isotope Laboratories公司，99.9%)。3-三甲基硅烷基-2,2,3,3-四氘代丙酸钠(TSP，德国Merck公司)。

1.2 动物分组与处理 健康成年雄性SD大鼠16只，体重200～250g，购自第二军医大学动物中心。SD大鼠随机分为实验组和正常对照组，每组8只。采用苏州大学医学部的全自动动态染毒装置，将实验组大鼠暴露于CO(230ppm)和苯(20ppm)混合气体中，每天固定时间染毒4h，随后同时进行辐照和噪声暴露。辐照采用60Co放射源和252Cf源照射，低剂量γ照射1h，低剂量中子照射20h，照射剂量率分别为0.072Gy/h和0.085mGy/h。噪声暴露采用反应堆周围机械噪声录音重放，暴露动物区声音强度90±5dB，每天暴露2h。实验组动物连续处理7d。正常对照组动物不进行任何处理。

1.3 血清样本制备 实验结束时剖杀动物，腹主动脉取血，常规分离血清，4℃下3000r/min离心10min，取上清1.5ml至离心管，向管中依次加入含100μl TSP的重水溶液(1mg/ml)、300μl血清以及200μl重水，充分振荡混匀后14 000r/min离心10min，取550μl上清加入5mm核磁共振管中待用。

1.4 NMR数据采集 分别采用弛豫编辑脉冲序列[CPMG脉冲序列，-RD-90°-(-180°-)n-ACQ]和扩散编辑脉冲序列(LEDbpp脉冲序列，-RD-90°-G1-180°-G1-90°-T-90°-G1-180°-G1-90°-90°-ACQ)采集血清样本的数据，以观测血清中的小分子代谢产物和脂类代谢产物。CPMG实验的谱宽为8000Hz，采样点数64k，采样时间4s，累加次数64次，τ为200μs，2nτ 为320ms，弛豫延迟为2s，其间采用低功率脉冲对水峰进行预饱和。LEDbpp实验的谱宽为8000Hz，采样点数64k，采样时间4s，累加次数64次，扩散时间为100ms，τ为5ms，弛豫延迟为2s，其间采用低功率脉冲对水峰进行预饱和。在对自由感应衰减(free induction decay，FID)信号数据进行填零，分别加上1Hz(CPMG实验)和3Hz(LEDbpp实验)的线增宽因子后进行傅立叶变换得到1H NMR谱图。以乳酸甲基信号双峰的左侧峰定标为1.33。

1.5 NMR数据处理 对所得NMR数据经傅立叶变换得到谱图，然后调整相位并进行基线校正。对CPMG数据，将0.4～4.4范围内的谱按照每段0.04ppm进行分段积分。对LED数据，将0～6.0范围内的谱按照每段0.04ppm进行分段积分，并将4.6～5.0之间的谱排除。将积分按每张谱的总积分强度归一化。

1.6 统计学处理 将检测所得数据输入SIMCA-P+软件(V10.04，Umetrics，Umeå，Sweden)进行多元统计分析。数据采用平均中心化(mean centering) 或Pareto标度化(Pareto scaling)进行预处理之后进行主成分分析(PCA)。必要时可对数据采用正交信号校正(orthogonal signal correction，OSC)处理，然后再进行偏最小二乘(PLS)分析。分析结果以得分图(scores plot)和载荷图(loadings plot)的形式表示。

2 结 果

2.1 大鼠血清样本的1H NMR谱图 正常对照组和实验组大鼠血清样本的弛豫编辑(图1)和扩散编辑(图2)1H NMR谱图中波峰有明显差异，提示两组大鼠血清小分子代谢产物和脂类代谢产物成分有明显差异。

图1 大鼠血清样本弛豫编辑(CPMG)1H NMR图谱Fig.11H NMR CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) spectra of rats serum A. Control group; B. Exposed group

图2 大鼠血清样本扩散编辑(LED)1H NMR图谱Fig.21H NMR LED (longitudinal eddy-delay) spectra of rats serumA. Control group; B. Exposed group

2.2 CMPG1H NMR模式识别 正常对照组和实验组大鼠血清样品CMPG1H NMR谱的OSC-PLS分析结果如图3所示。模型参数R2X(cum)=44.6%，R2Y(cum)=96.3%，Q2(cum)=76.4%。对应的得分图(图3A)的积分值集中分布于散点图的椭圆内(95%可信区间)，说明模型拟合效果好，两组的分布区域基本能区分开来。对应的载荷图(图3B)显示，与正常对照组比较，实验组大鼠血清中脂类、甘氨酸/葡萄糖含量增加，乳酸、苏氨酸/脂质、丙氨酸、肌酸、甘油磷脂酰胆碱/氧化三甲胺含量降低(表1)。

图3 实验组(■)和正常对照组(▲)大鼠血清弛豫时间编辑(CPMG)1H NMR图谱的OSC-PLS分析结果Fig. 3 OSC-PLS analysis of serum from exposed group (■) and control group (▲) based on1H NMR CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill) spectra A. Score plot; B. Loading plot. R2X(cum)=44.6%; R2Y(cum)=96.3%; Q2(cum)=76.4%

2.3 LED1H NMR模式识别 正常对照组和实验组大鼠血清样品LED1H NMR谱的PLS-DA分析结果如图4所示。模型参数R2X(cum)=73.9%，R2Y(cum)=98.5%，Q2(cum)=97.1%。对应的得分图(图4A)的积分值集中分布于散点图的椭圆内(95%可信区间)，说明模型拟合效果好，两组的分布区域完全分开。对应的载荷图(图4B)显示，与正常对照组比较，实验组大鼠血清中高密度脂蛋白、N-乙酰糖蛋白1、N-乙酰糖蛋白2、不饱和脂肪酸、磷脂酰胆碱含量增加，低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白/高密度脂蛋白、极低密度脂蛋白/低密度脂蛋白、饱和脂肪酸含量降低(表2)。

表1 大鼠血清小分子代谢产物浓度变化Tab.1 Concentration change of micromolecular metabolites in rats serum

3 讨 论

本研究采用1H NMR技术对低剂量电离辐射、一氧化碳、苯和噪声复合环境因素暴露下的大鼠血清进行检测，结果发现，复合环境因素暴露组与正常对照组的血清代谢产物谱存在显著差异，多种代谢成分发生了变化。1H NMR模式识别的得分图显示实验组与正常对照组代谢产物分布的区域可完全分开，说明该模型可区分复合环境因素暴露组与正常对照组，代谢组学技术是开展复合环境因素生物效应及作用机制研究的有效手段。

图4 实验组(■)和正常对照组(▲)血清扩散编辑(LED)1H NMR图谱的OSC-PLS分析结果图Fig. 4 OSC-PLS analysis of serum from exposed group (■) and control group (▲) based on1H NMR LED (longitudinal eddydelay) spectraA. Score plot; B. Loading plot. R2X(cum)=73.9%; R2Y(cum)=98.5%; Q2(cum)=97.1%

表2 大鼠血清脂类代谢产物浓度变化Tab. 2 Concentration change of lipid metabolites in rats serum

本研究结果显示，实验组血清中甘氨酸/葡萄糖含量增加，乳酸、肌酸含量降低，说明复合环境因素导致大鼠糖代谢发生紊乱，糖酵解过程被抑制。乳酸是糖酵解过程正常代谢产物，也是体内三羧酸循环的中间产物，在缺氧条件下在乳酸脱氢酶的催化下由丙酮酸生成，维持机体正常的能量代谢[7]。肌酸是体内细胞能量代谢的中间产物。低剂量电离辐射、一氧化碳、苯和噪声复合环境因素作用下乳酸和肌酸含量的变化提示机体能量代谢发生异常。实验组血清中脂类、磷脂酰胆碱、高密度脂蛋白(HDL)含量增加，低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)含量降低，提示机体脂代谢发生了变化。磷脂酰胆碱是位于细胞膜上的磷脂，可作为一种贮存的脂类来源，也可在体内将血液中的胆固醇和脂肪酸乳化为极细的颗粒从血管中排出。复合环境导致大鼠血清中磷脂酰胆碱含量增加，进一步提示机体脂代谢发生了变化。

丙氨酸是体内重要的非必需氨基酸，有研究显示丙氨酸是淋巴细胞再生及免疫过程中重要的参与者[8]。N-乙酰糖蛋白是急相反应时血清中检测到的糖蛋白，其含量变化反映了免疫系统的炎症反应[9-11]。本研究发现，复合环境因素作用下，大鼠血清中丙氨酸含量降低，N-乙酰糖蛋白含量增加，提示低剂量电离辐射、一氧化碳、苯和噪声的复合作用造成了机体的免疫功能受损。

氧化三甲胺、甘氨酸、胆碱类衍生物如磷脂酰胆碱、甘磷酸胆碱是甲胺类物质代谢循环的中间产物或其衍生物，对维持肾脏功能具有重要作用[12]。胆碱类衍生物是肾髓质的主要细胞渗透调节物，其含量变化提示肾脏代谢紊乱。有研究发现，在肾细胞癌患者体内此类有机渗透调节物含量存在异常[13]。氧化三甲胺也是一种反映肾脏慢性病变的生物标志物[14]，本研究中实验组大鼠血清内氧化三甲胺含量变化说明肾脏功能出现障碍。此外，氧化三甲胺与肠道菌群也有密切关系，其含量变化也提示复合环境因素可导致机体肠道菌群结构发生变化。

综上所述，本研究结果提示，低剂量电离辐射、一氧化碳、苯和噪声有害环境因素对机体的复合作用可能与免疫功能受损、肾功能受损、能量代谢异常有关。长期暴露于多种有害环境因素的职业人群，其健康可能因多种环境因素复合作用导致机体代谢紊乱而受损，因此，在采取防护措施和制定行业卫生标准时，应充分考虑环境因素的复合效应。

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Study on serum metabonomics of rats exposed to low-dose ionizing radiation, carbon monoxide, benzene and noise

WANG Qing-rong, SHEN Xian-rong*, HE Ying, LIU Yu-ming, LI Ke-xian, CHEN Wei, JIANG Ding-wen, HOU Deng-yong
Naval Medical Research Institute of PLA, Shanghai 200433, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: xianrong_sh@163.com

, E-mail: xianrong_sh@163.com
This work was supported by the Science Technology Program of the General Logistics Department of PLA (AHJ09J012) and the Tackle Key Problems in Science Technology Program of the General Logistics Department of PLA (2009183006)

ObjectiveTo investigate the combined effects of low-dose ionizing radiation, carbon monoxide, benzene and noise on serum metabolites and the mechanism of injury induced by these complex environmental factors in rats.MethodsSixteen adult SD rats were randomly divided into control group and exposed group (8 each). The exposed group

the combined effect every day for 7 days. At the end of experiment, sera were collected from the abdominal aorta of rats. The metabolic fingerprint of serum was obtained by1H nuclear magnetic resonance (1H NMR) spectroscopy and determined with pattern recognition techniques of principal component analysis (PCA) and orthogonal signal correction-partial least squares (OSC-PLS). The similarities and differences in metabolic profiles between two groups were visualized by SIMCA-P software.ResultsThe rat serum1H NMR spectra revealed different metabolic spectra between the control group and exposed group. The OSC-PLS plots of the serum samples presented respectively marked clustering between the two groups. Compared with the control group, the contents of lipid, high density lipoprotein, glycine/glucose, N-acetyl glycoprotein 1, N-acetyl glycoprotein 2, phosphatidyl choline and unsaturated fatty acid increased, while those of lactic acid, threonine/lipid, alanine, creatine, glycerylphosphorylcholine/ trimethylamine oxide, low density lipoprotein/high density lipoprotein, low density lipoprotein, very low density lipoprotein/ low density lipoprotein, very low density lipoprotein and saturated fatty acid decreased.ConclusionsCombination of low-dose ionizing radiation, carbon monoxide, benzene and noise could induce changes of serum metabolites in rats, involving in immunefunction, renal function and energy metabolism. The NMR-based-metabonomics method has potential of application in research on combined biological effects of the complex environmental factors.

radiation injuries; carbon monoxide; benzene; noise; metabolomics

R148；R135

A

0577-7402(2015)07-0559-05

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.07.09

2014-12-27；

2015-01-15)

(责任编辑：李恩江)

全军后勤科研计划项目(AHJ09J012)；总后科技攻关项目(2009183006)

王庆蓉，高级实验师。主要从事辐射生物效应与医学防护方面的研究

200433 上海 海军医学研究所(王庆蓉、沈先荣、何颖、刘玉明、李珂娴、陈伟、蒋定文、侯登勇)

沈先荣，E-mail：xianrong_sh@163.com