miR-155对HBV蛋白表达的抑制作用及机制

蔡启茵，任广立，张卫云，冯宇鹏，马恒颢

miR-155对HBV蛋白表达的抑制作用及机制

蔡启茵，任广立，张卫云，冯宇鹏，马恒颢

目的观察miR-155对SOCS1 mRNA及蛋白水平的影响，探究miR-155对HBsAg、HBeAg表达的抑制作用。方法从HepG2.2.15细胞中提取基因组，经PCR扩增得到miR-155前体序列，纯化并连接入pmR-mCherry载体，构建重组质粒pmiR-155，经去内毒素后转染至HepG2.2.15细胞。将细胞分为重组组(转染pmiR-155质粒)、空载组(转染pmR-mCherry质粒)、转染试剂组、空白组。采用荧光实时定量PCR检测各组细胞内miR-155的表达，RT-PCR检测各组细胞SOCS1 mRNA的表达，Western blotting检测各组细胞SOCS1 蛋白的表达，ELISA检测各组细胞HBsAg、HBeAg的表达。结果荧光实时定量PCR结果显示，以空白组细胞内miR-155的表达量为基准，重组组miR-155表达量(519.43±52.10)明显高于空载组(24.24±16.70)及转染试剂组(35.04±26.09，P＜0.05)；RT-PCR结果显示，重组组SOCS1 mRNA表达量(0.63±0.91)显著低于空白组(P＜0.05)；Western blotting结果显示，重组组SOCS1蛋白表达量显著低于空白组。以空白组的表达量为基准，重组组HBsAg和HBeAg蛋白表达的抑制率分别为55.62%±3.77%和47.87%±2.46%(P＜0.01)。结论过表达的miR-155可抑制细胞内SOCS1和HBV蛋白的表达。

乙型肝炎，慢性；微RNAs；乙型肝炎表面抗原；乙型肝炎核心抗原

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)呈全球性流行，每年约100万人死于HBV相关的肝衰竭或原发性肝癌。干扰素和核苷类似物是目前抗HBV的主要药物[1]，可在一定程度上抑制HBV的复制，减轻肝损害，但无法彻底清除体内的病毒[2]。最近研究发现，miRNAs不仅可干扰病毒聚合酶或相关蛋白合成，而且可改变抗原提呈，从而达到抑制病毒复制的作用[3]。miR-155被认为是新兴的炎症因子，可调控免疫系统发育和应答、抗病毒感染等生物进程[4]。研究指出，miR-155通过抑制细胞因子信号转导抑制因子1(suppressor of cytokine signaling1，SOCS1)调节体内的干扰素信号通路，增强抗病毒效应[5]。然而，目前尚无证据证明特定的miRNA可通过调控信号通路来达到干扰HBV表达的作用。本研究通过构建miR-155真核过表达载体，体外转染HepG2.2.15细胞，从蛋白和基因水平评估miR-155 对SO CS1表达的影响，同时观察细胞所分泌HBsAg、HBeAg水平的改变，为进一步研究miR-155 在HBV慢性感染中抗病毒作用提供线索。

1 材料与方法

1.1 主要材料及试剂 pmR-mCherry质粒由美国Dr. Keith Peden惠赠。大肠埃希菌菌株DH5α及肝癌细胞株HepG2.2.15细胞由本院医学实验科保存。PCRTaq、QuickCutEcoR Ⅰ、QuickCutBamH Ⅰ、T4DNA连接酶及DNA切胶回收试剂盒均购自TaKaRa公司；去内毒素质粒小提中量试剂盒购自Omega公司；Trizol总RNA提取试剂盒、脂质体Lipofectamine 2000及M-MLV 1st strand Kit购自Invitrogen公司；抗SOCS1多克隆抗体购自Cell Signaling公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(二抗，1:4 000)购自北京中杉金桥科技有限公司；乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒、乙型肝炎病毒e抗原诊断试剂盒购自深圳华康生物医学有限公司；用于荧光定量PCR检测的miR-155及U6特异性引物均为广州锐博生物科技有限公司产品。

1.2 载体构建 根据miRBase及GenBank数据库查找得到成熟miR-155茎环序列及miR-155前体侧翼序列，利用Primer 5.0及Oligo 7设计引物(表1)。以HepG2.2.15细胞基因组为模板PCR扩增得到miR-155前体序列，经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切，退火连接到pmR-mCherry载体，克隆转化、摇菌、测序鉴定后，得到重构质粒pmiR-155。去内毒素提取重组质粒用于转染实验[6]。

1.3 HepG2.2.15细胞培养及转染 将HepG2.2.15细胞培养于含200mg/L G418、100g/L FBS、10万U/L青链霉素、10g/L L-谷氨酰胺的高糖DMEM培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中培养。细胞传代培养3次后消化接种至6孔板，4.8×105个细胞/孔，培养24h后待细胞融合度达80%时转染(转染时不加双抗)[7]。设重组组(转染pmiR-155质粒)、空载组(转染pmR-mCherry质粒)、转染试剂组、空白组。转染试剂Lipofectamine 2000(μl)与质粒(μg)的比例为3:1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.4 荧光实时定量PCR检测各组miR-155表达 应用Trizol法提取各组细胞中总RNA，经紫外分光光度法测定浓度及纯度后，采用茎环法[8]反转录得到cDNA，进行荧光实时定量PCR反应。反应程序为95℃ 10s，60℃ 20s，70℃ 10s，循环40次。所得数据采用2-ΔΔCt表示，并评估样本间差异。

1.5 RT-PCR检测各组SOCS1 mRNA表达 应用Trizol法提取各组总RNA，反转录得到cDNA，行RT-PCR。反应程序：94℃ 30s，57℃ 30s, 72℃30s，循环30次。GAPDH序列的PCR反应程序除退火温度改为56℃外，其余与SOCS1相同。所得产物经凝胶电泳及测序鉴定。应用Gel-pro Analyzer分析各组mRNA的相对表达量。

1.6 Western blotting检测各组SOCS1蛋白表达转染72h后收集各组细胞，用预冷PBS冲洗3遍，每孔加入100μl裂解液，冰上放置30min后移入离心管，4℃、12 000r/min离心30min，收集上清液。BCA法测定蛋白浓度。加入50μl 2×上样缓冲液混匀，99℃煮10min，取50μg样品行12% SDS-PAGE凝胶电泳。电泳结束后用半转移仪将蛋白从凝胶转移到PVF膜，封闭液封闭，先后与抗SOCS1多克隆抗体(1:1 000稀释)和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1:4 000稀释)孵育，洗膜，加入化学发光剂ECL，在Sage Creation凝胶成像仪中曝光显影。

1.7 HBsAg和HBeAg蛋白的检测 收集细胞转染24、48h和72h的培养上清液，1000r/min离心5min，吸取上清，应用ELISA法检测各组细胞HBsAg和HBeAg的分泌量。严格按试剂盒说明操作，结果用吸光度(A)值表示。

1.8 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析，所有数据均以表示，组间均数比较采用One-Way ANOVA法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-155真核过表达载体的构建及鉴定 经测序鉴定，PCR扩增的人miR-155前体序列连入pmR-mCherry真核过表达载体，序列正确，没有碱基丢失、替换等，重组质粒构建成功(图1)。

2.2 miR-155在转染细胞中的表达 经荧光实时定量PCR检测，以空白组细胞内miR-155的表达量为基准，重组组miR-155表达量(519.43±52.10)明显高于空载组(24.24±16.7)及转染试剂组(35.04±26.09，P＜0.05)。

2.3 miR-155对SOCS1 mRNA表达的抑制作用RT-PCR检测结果表明，以GAPDH表达为参照，空载组(0.95±0.79)、转染试剂组(0.94±0.52)与空白组SOCS1 mRNA的表达量无明显差异，重组组SOCS1 mRNA的表达量(0.63±0.91)显著低于空白组(P＜0.05，图2)。

2.4 miR-155对SOCS1蛋白表达的抑制作用Western blotting检测表明，以β-actin表达为参照，转染72h后，空载组、转染试剂组与空白组SOCS1蛋白表达量均无明显差异，而重组组SOCS1蛋白表达量显著低于空白组(P＜0.05，图3)。

2.5 miR-155对HBsAg和HBeAg蛋白表达的抑制作用 ELISA检测结果表明，转染后重组组培养上清液的HBsAg、HBeAg表达量明显受到抑制，尤其是转染后48h。空载组、转染试剂组对蛋白的表达几乎没有影响。转染48h时，重组组HBsAg和HBeAg蛋白表达的抑制率分别为55.62%±3.77%和47.87%±2.46%，与其他3组相比差异均有统计学意义(P<0.05，图4)。

图1 重组质粒pmiR-155部分核酸序列测序结果Fig.1 Sequencing results of partial nucleic acid of recombinant plasmid pmiR-155

图2 RT-PCR检测转染后各组细胞内SOCS1 mRNA表达Fig.2 Expression of SOCS1 mRNA in each group (RT-PCR) M. DL2000; 1. pmiR-155 plasmid group; 2. pmR-mCherry plasmid group; 3. Reagent group; 4. Blank group

图3 Western blotting检测转染后各组细胞SOCS1蛋白表达Fig.3 Expression of SOCS1 proteins in each group (Western blotting)1. pmiR-155 plasmid group; 2. pmR-mCherry plasmid group; 3. Reagent group; 4. Blank group

图4 ELISA检测转染后各组细胞HBsAg(A)和HBeAg(B)蛋白表达Fig.4 Expression of HBsAg (A) and HBeAg (B) proteins in each group (ELISA)

3 讨 论

miRNA可通过降解靶细胞mRNAs或抑制蛋白翻译来调控转录后期的基因表达[9-10]。miR-155是21nt的小分子RNA，在抗病毒感染、抗肿瘤和免疫调节中发挥重要作用[11-13]。Banerjee等[14]研究发现，miR-155通过激活IFN-γ信号通路诱导Th1细胞分化，活化CD4+T细胞来调节免疫系统稳定。Rodriguez等[15]证实miR-155可作用于IL-2信号途径，抑制SOCS1的表达，从而影响调节性T细胞的分化能力。此外，研究已证实了SOCS1是miR-155的靶位点，可负反馈性阻断细胞因子信号转导过程(如干扰素、IL-10、IL-12等信号通路)[16]。miR-155抑制SOCS1表达后可削弱其对相关细胞因子的负反馈调节，促进细胞因子的分泌，增强抗病毒作用。然而，在HBV慢性感染中，miR-155对SOCS1的抑制及干扰HBV蛋白分泌的作用及机制尚未明确。

本研究所选用的H BV慢性感染细胞模型HepG2.2.15细胞能持续分泌HBV蛋白及表达HBV DNA，是探讨miR-155在HBV慢性感染中所发挥作用的较佳细胞模型。目前尚未见在HepG2.2.15细胞中研究miR-155对SOCS1表达影响的报道。本研究成功构建了人miR-155真核过表达载体，并转染至HepG2.2.15细胞，结果显示，SOCS1的mRNA和蛋白表达量随着细胞内的miR-155表达上调而下降，且转染了人miR-155过表达载体的HepG2.2.15细胞HBsAg、HBeAg分泌量也明显降低。

综上，本研究证实了在HBV慢性感染中，过表达miR-155可抑制SOCS1及HBV蛋白的表达，其作用机制很有可能是由于过表达的miR-155下调了SOCS1的表达，削弱了其负反馈调节，增强了机体的抗病毒作用，从而抑制HBsAg、HBeAg的表达。本研究结果为进一步探讨miR-155在HBV慢性感染中的免疫调节及抗病毒作用奠定了基础，并为miRNAs治疗HBV提供了实验证据。

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Inhibitory effect of miR-155 on expression of hepatitis B virus and its mechanism

CAI Qi-yin, REN Guang-li*, ZHANG Wei-yun, FENG Yu-peng, MA Heng-hao
Department of Pediatrics, General Hospital of Guangzhou Command, Guangzhou 510010, China
*< class="emphasis_italic">Corresponding author, E-mail: guangliren@hotmail.com

, E-mail: guangliren@hotmail.com
This work was supported by the Science and Technology Foundation of Guangzhou (2013J4100116)

ObjectiveTo investigate the mechanism of miR-155 regulating SOCS1 in the inhibition of HBsAg and HBeAg.MethodsThe pre-miR-155 was amplified from total DNA of HepG2.2.15 by PCR. The target gene fragment was digested and cloned into the pmR-mCherry plasmid. PmiR-155 was transfected into HepG2.2.15 cells (recombinant group) by liposome-mediated method. The empty plasmid, the reagent group and untreated cells were set as control. Firstly the expression of miR-155 was detected by the real-time quantitative PCR. Secondly, the expression of SOCS1 mRNA was detected by RT-PCR, and then the expression of SOCS1 protein was determined by Western blotting. Finally, the expression of HBsAg and HBeAg was determined by ELISA.ResultsThe pmiR-155 eukaryotic over-expression vector was successfully constructed. MiR-155 level of HepG2.2.15 cells which was transfected with the recombinant plasmid (519.43±52.10) was obviously higher than those of the empty plasmid (24.24±16.70) and reagent groups (35.04±26.09,P<0.05). RT-PCR showed the expression of SOCS1 mRNA was lower in recombinant group than in untreated group. The expression of SOCS1 protein markedly decreased as shown with Western blotting. Over-expression of miR-155 could inhibit the expressions of HBsAg and HBeAg (55.62±3.77)% and (47.87±2.46)% (P<0.01) respectively.ConclusionsOver-expression of miR-155 can down regulate the expression of SOCS1, and inhibit the expressions of HBsAg and HBeAg.

hepatitis B, chronic; microRNAs; hepatitis B surface antigens; hepatitis B core antigens

R512.6

A

0577-7402(2015)11-0902-04

10.11855/j.issn.0577-7402.2015.11.09

2015-05-18；

2015-07-29)

(责任编辑：熊晓然)

广州市科技计划项目(2013J4100116)

蔡启茵，医学硕士。主要从事儿科病毒感染性疾病的研究

510010 广州 广州军区广州总医院儿科(蔡启茵、任广立、张卫云、冯宇鹏、马恒颢)

任广立，E-mail: guangliren@hotmail.com