冻融卵裂期胚胎移植中过夜培养对临床妊娠结局的影响

李 荣，许常龙，谭秀群，邓志华，李春苑，丘 映

(南宁市第二人民医院生殖医疗中心，广西 南宁 530031)

冻融卵裂期胚胎移植中过夜培养对临床妊娠结局的影响

李 荣，许常龙，谭秀群，邓志华，李春苑，丘 映

(南宁市第二人民医院生殖医疗中心，广西 南宁 530031)

目的 探讨冻融卵裂期胚胎移植中过夜培养对临床妊娠结局的影响。方法 2011年12月至2012年12月在我院生殖医疗中心接受玻璃化冷冻的卵裂期胚胎移植患者共237个周期，其中胚胎解冻时间为移植当日128个周期(A组)，过夜培养109个周期(B组)，比较两组的胚胎种植率、临床妊娠率、流产率。结果 A组胚胎种植率低于B组(P< 0.05)，而临床妊娠率和流产率与B组，差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 将胚胎提前解冻培养过夜，观察解冻后胚胎的进一步发育情况，可提高胚胎种植率，为临床选择移植胚胎提供有意义的参考。

冻融胚胎移植；玻璃化冷冻；过夜培养；胚胎种植率；临床妊娠率

目前冻融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，FET)已成为辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)技术中不可缺少的一部分。但是，胚胎细胞在程序冷冻法冷冻过程中容易形成冰晶，损伤细胞膜及细胞内结构，对细胞造成致命的伤害，而玻璃化冷冻可以很好地解决这一问题[1]。影响玻璃化冻融胚胎移植的因素很多，本研究通过提前解冻胚胎培养过夜，观察胚胎进一步发育情况，探讨胚胎过夜培养对FET妊娠结局的影响，为临床提高FET妊娠率提供帮助。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2011年12月至2012年12月在我中心接受冻融卵裂期胚胎移植的患者237个周期。患者年龄20～47岁[(32.11±4.55)岁]；常规体外受精-胚胎移植(IVF)周期155例，卵胞浆内单精子注射(ICSI)周期82例。均符合以下标准：不孕因素为输卵管阻塞和(或) 男性少弱精；均为首次 IVF 或 ICSI 治疗未育且移植玻璃化冷冻第3天卵裂期胚胎的周期。排除：程序化冷冻胚胎移植周期、囊胚移植周期、解冻后继续培养成囊胚再移植周期。其中移植当日解冻胚胎128个周期(A组)，过夜培养109个周期(B组)。A组年龄(32.22±4.77)岁，平均解冻胚胎数(2.33±0.59)个，B组年龄(32.11±4.55)岁，平均解冻胚胎数(2.20±0.50)个，两组一般情况比较差异无统计学意义(P> 0.05)。

1.2 方法

1.2.1 超促排卵 两组取卵周期超排卵方案均采用我中心常规长方案：在前次月经周期的第18～20天(黄体中期)使用促性腺激素释放激素类似物(GnRHa，达菲林)降调节，注射剂量0.8～1.3 mg，14～16天后复诊，在达到降调节标准后开始使用促性腺激素(Gn)，结合阴式超声及血清黄体生成素(LH)、雌二醇(E2)、孕激素(P)水平测定，确定人绒毛膜促性腺激素(hCG)日。当主导卵泡中1个直径达18 mm或2个达17 mm或3个达16 mm时，可于当天停用Gn，并在当日22点注射hCG 5000～10000 IU，35～37 h后行阴道B超指引下经阴道穿刺取卵术。取卵后根据患者丈夫精液情况采用IVF或ICSI，胚胎培养，取卵后3天移植胚胎，并将剩余的优质胚胎予以玻璃化冷冻、保存。FET建议至少于取卵术后三个月进行。

1.2.2 冻融胚胎移植内膜准备 ①自然排卵周期：适用于月经规律，无排卵障碍者，于月经第10～12天开始经阴道超声监测到优势卵泡发育至15 mm时，于血清LH峰后3天或排卵后2天行冷冻胚胎移植。②激素替代周期：应用于月经周期紊乱及多囊卵巢综合征及子宫内膜异位症或其它原因导致排卵障碍者：月经第3～5天口服戊酸雌二醇，根据患者内膜情况，选择不同起始剂量(4～8 mg/d)，服用5～7天后予以B超，以观察其子宫内膜厚度。超声监测须至子宫内膜厚度≥8 mm，测定E2水平，当E2> 200 pmol/L时肌内注射黄体酮60 mg/d，同时继续口服戊酸雌二醇。用黄体酮第4天行冷冻胚胎移植。胚胎移植后根据不同子宫内膜准备方案及患者个体情况应用不同剂型剂量的孕酮进行黄体支持。

1.2.3 胚胎冷冻与解冻 ①试剂与耗材的准备：玻璃化冷冻试剂盒(Vitrification Kit)；玻璃化解冻试剂盒(Thawing Kit)；玻璃化冷冻载体(JY straw)；剥卵针(Denuding Pipettes)D160和D190。加拿大捷鹰公司(JIEYING Laboratory Inc.)；冷冻皿：Falcon3001；⑥解冻皿：Embryo GPS-010；⑦胚胎培养液：Votrolife 10131。②冷冻操作过程：制备冷冻皿，室温下平衡20min后，将选择用于冻存的胚胎1—2枚胚胎置于冷冻液JY-Vl中5 min，再转入冷冻液JY-V2中1min立即将胚胎置于载体上，套上外套管，迅速将载体完全浸入液氮中，静置10秒左右即可液氮罐贮存。③复苏操作过程：制备解冻皿，室温下平衡20min后，将冻胚载体从液氮取出，迅速置于解冻液JY-T1中3 min，再转入稀释液JY-T2中3 min，后转入稀释液JY-T3中3 min，后转入冲洗液JY-T4中3 min，胚胎移入JY-T4后立即将恒温板温度升至37 ℃，最后转移至胚胎培养液中，37 ℃ 6%CO2培养箱内培养。

1.3 胚胎解冻时间 ①A组：移植当日上午解冻胚胎，选择复活卵裂球≥50%的胚胎进行移植。将解冻后存活的1～3个胚胎培养2 h后移植。②B组：移植前一天下午解冻胚胎，观察胚胎如有50%以上卵裂球受损，则解冻其他保存的胚胎，培养过夜。移植时应观察复苏后胚胎生长情况，<50% 卵裂球受损，或至少有一个卵裂球发生卵裂，方可用于移植。

1.4 胚胎解冻后观察指标及妊娠确定 优质胚胎评价标准为获卵后第1 日(Day1)观察正常受精、第3日(Day3)评分为Ⅰ、Ⅱ级，卵裂球6～12个的胚胎。以解冻后胚胎存活的卵裂球数≥50%总细胞数作为胚胎复苏存活的标准。冻融胚胎移植后14天测血HCG判断是否生化妊娠，在移植后4～5周经B超确定临床妊娠。

1.5 统计学方法 应用SPSS 18.0统计软件进行数据处理。计量资料采用t检验，计数资料采用四格表χ2检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

237个冻融胚胎周期，解冻胚胎538枚，共移植冻融胚胎509枚，平均每周期移植(2.15±0.53)枚胚胎，其中124枚胚胎着床(冻融胚胎种植率为24.36%)，98例临床妊娠(临床妊娠率为41.35%)，13例流产(流产率为13.27%)，4例宫外孕(宫外孕发生率为1.68%)，81例分娩。A组胚胎种植率低于B组，而临床妊娠率和流产率与B组比较差异无统计学意义，见表1。

表1 两组胚胎种植率、临床妊娠率、流产率比较 [%(n)]

3 讨论

胚胎质量和胚胎与子宫内膜间是否能够相互适应是胚胎着床成功与否的关键之处[2]。相关研究表明，早期卵裂胚胎来自胞浆和核同步性较好，并且较为成熟的卵子，具有较好的代谢储备性能，其IVF-ET成功率也较高。但是，冷冻和复苏可导致卵裂球部分或全部裂解甚至凋亡，从而影响胚胎发育潜能。ALIKANI研究发现显微操作损伤鼠胚中的部分卵裂球后，囊胚孵出率显著降低[3]。因此，去除坏死的卵裂球，则可有效提高冻融移植周期的临床妊娠率[4]。目前，移植胚胎的选择标准多是根据解冻后2～3 h 的胚胎形态来决定，但随着商品化序贯培养试剂、培养条件及培育技术的不断完善与改进，根据冻融胚胎的继续发育状况与潜能将成为以后移植胚胎选择的新标准。陆湘等[5]发现，通过过夜培养，可使复苏后部分破损卵裂球继续生长、卵裂，恢复正常种植潜能。龚绍琼等[6，7]认为提前解冻培养、选择进一步卵裂的胚胎进行移植，有助于提高FET周期临床妊娠率，改善妊娠结局。但罗金等[8]则发现提前一天解冻和当天解冻，对临床妊娠率的影响差异无统计学意义。

本研究根据胚胎解冻时间分为移植当日解冻组和过夜培养组，结果显示过夜培养组胚胎种植率高于移植当日解冻组，差异有统计学意义(P< 0.05)。两组临床妊娠率、流产率差异无统计学意义(P> 0.05)。与柴三明等[7]研究结果相似。提示在临床中，可通过提前解冻胚胎过夜培养，观察胚胎复苏后进一步发育情况，评估其发育潜能，选择优质的胚胎进行移植。

[1] 耿洁，胡玉琴，刘兰兰.卵子玻璃化冷冻在体外受精-胚胎移植取精失败周期中的应用[J].实用医院临床杂志，2014，11(1)：156-157.

[2] 王静，李豫峰，冻融胚胎移植结局的影响因素研究进展[J].中国优生与遗传杂志，2009，17(2)：6-8，110.

[3] Alikani M，Olivennes F，Cohen J.Microsurgieal correction of partially degenerate mouse embryos promotes hatching and restores their viability[J].Hum Reprod，1993，8(10)：1723-1728.

[4] Rienzi L，Ubaldi F，Iacobelli M，et al.Developmental potential of fully intact and partially damaged cryopreserved embryos after laser-assisted removal of necrotic blastomeres and post-thaw culture selection[J].Fertil Steril，2005，84(4)：888-894.

[5] 陆湘，李路，高晓红，等.卵裂球的完整性和生长与否对冻融胚胎移植妊娠结局的影响[J].生殖与避孕，2007，27(8)：518-521.

[6] 龚绍琼.移植复苏后进一步卵裂胚胎可提高冻融胚胎移植临床妊娠率[J].现代医院，2012，12(7).11-13.

[7] 柴三明，王琰，倪亚莉.过夜培养对冻融胚胎移植周期妊娠结局的影响[J].生殖与避孕，2010，30(7).490-493.

[8] 罗金，杨菁，徐望明.胚胎冻融后体外培养时间对妊娠结局的影响[J].生殖与避孕，2011，31(2)：97-100.

Impact of culture overnight during frozen-thawed cleavage-stage embryo transfers on pregnancy outcome

LI Rong，XUE Chang-long，TAN Xiu-qun，DENG Zhi-hua，LI Chun-yuan，QIU Ying

(Reproductive Medical Center，Nanning Second People’s Hospital，Nanning 530031，China)

QIUYing

Objective To explore the impact of culture overnight during frozen-thawed cleavage-stage embryo transfers on pregnancy outcome.Methods Data of 237 cycles of vitrified cleavage-stage embryos from the Third Affiliated Hospital between December 2011 and December 2012 was retrospectively analyzed.The embryo were divided into group A (embryo was thawed on the day of transplantation) and group B (embryo was culture overnight).The embryo implantation rate，clinical pregnancy rate and abortion rate were compared between the two groups.Results The embryo implantation rate was significantly lower in the group A when compared with that in the group B (P< 0.05).However，no significant difference in clinical pregnancy rate and abortion rate was found between the two groups.Conclusion It may provide a valuable reference for the selection of high quality of embryo when embryos are thawed in advance and cultured overnight，and then the development of embryos can be observed.This method also facilitates the arrangement of laboratory working.

Frozen embryo transplantation；Vitrification；Culture overnight；Embryo implantation rate；Clinical pregnancy rate

广西医科大学青年科学基金资助项目(编号：GXMUYSF201307)

丘 映

R714；S821.3+6

A

1672-6170(2015)04-0055-03

2014-12-23；

2015-03-24)