噬菌体展示库筛选构建血管细胞黏附分子－1单链抗体及其效价检测＊

刘纯宝， 宋夷龄， 张永学

华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，武汉 430022

噬菌体展示库筛选构建血管细胞黏附分子－1单链抗体及其效价检测＊

刘纯宝， 宋夷龄， 张永学△

华中科技大学同济医学院附属协和医院核医学科，武汉 430022

目的 从噬菌体重组抗体库中筛选获得靶向血管细胞黏附分子－1（Vcam－1）的单链抗体，纯化浓缩后进行亲和性鉴定，并与单克隆抗体效价进行比较。方法 扩增Vcam－1基因克隆质粒并转入真核细胞中表达获得Vcam－1抗原蛋白，纯化后包被免疫管，通过4轮压力逐渐增大的“吸附－洗脱－扩增”过程筛选获得阳性克隆。对阳性克隆进行ELISA检测，选取效价高的克隆送予测序并转入大肠埃希菌进行表达，认定高表达的样品为最终的阳性克隆。将该阳性克隆转染入感受态细胞表达单链抗体，纯化后经ELISA检测并评价其抗原亲和性。结果 真核细胞表达的Vcam－1抗原蛋白的分子量为85～90 k D。以Vcam－1抗原蛋白为免疫原筛选4轮所得的阳性克隆进行单噬菌体ELISA检测，从检测结果中选取9个效价高的克隆经基因测序共获得3个序列，其中1个序列对应的克隆高表达。表达的单链抗体分子量约30 k D，ELISA检测其对Vcam－1抗原蛋白有较高亲和性，效价较单克隆抗体低。结论 利用噬菌体展示技术获得了靶向Vcam－1的单链抗体，为随后的诊断和治疗应用奠定了基础。

噬菌体展示； 单链抗体； 血管细胞黏附分子－1； 重组抗体

抗体是疾病诊断和治疗的重要工具，抗体的制备经历了多克隆、单克隆和基因工程抗体三个阶段。单克隆抗体克服了多克隆抗体均一性差、易交叉反应、安全性不足等诸多缺陷，其较高的特异性使得其诊断和治疗的靶向性更专一。多克隆及单克隆抗体均为完整免疫球蛋白分子，分子量约150 k D，进入体内后不易穿透细胞，在血液循环中停留时间过长，因而限制了其在体内的诊断和治疗应用。单链抗体（single chain variable fragment antibody，scFv）是基因工程重组抗体，由抗体的重链可变区和轻链可变区通过人工合成的肽段连接而成，分子量27～30 k D，是远小于单克隆抗体的抗体片段［1］。

血管细胞黏附分子－1（vascular cell adhesion molecule 1，Vcam－1）是免疫球蛋白超家族成员，在活化的血管内皮细胞高表达，炎症因子（如IL－1，TNF－α）可诱导其表达［2］。Vcam－1参与炎症细胞的活化、迁移，在肿瘤转移病理过程中也有重要作用，对Vcam－1的监测可用于粥样硬化易损斑块和肿瘤内新生血管的评估。

噬菌体展示筛选方法是目前常用的单链抗体提取方法，其原理是将外源基因与噬菌体外壳蛋白基因融合，使抗体展示于噬菌体表面，通过筛选而得到所需单链抗体［3］。本研究利用噬菌体展示筛选法获得了Vcam－1单链抗体，并对其亲和性进行鉴定，为随后的Vcam－1体内研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 Vcam－1抗原蛋白的制备

以鼠源Vcam－1基因克隆质粒（购自北京义翘神州生物公司）为模板，在两端引入NheⅠ和XhoⅠ酶切位点，PCR扩增得到2 000 bp左右的产物，胶回收PCR产物并纯化。以NheⅠ和XhoⅠ双酶切胶回收产物，并将其连入同样酶切的真核表达载体pRAG1a中，DNA连接酶连接过夜，构建重组质粒并命名为p RAG1a－Vcam－1。以热击法将重组质粒转化入TOP10感受态细胞中。挑取p RAG1a－Vcam－1转化板上的克隆进行PCR鉴定，取PCR鉴定片段大小为2 000 bp左右的克隆测序验证。取验证正确的阳性克隆菌落加入培养液中摇菌过夜，用质粒中量抽提试剂盒（购自Axygen公司）抽提得到100μg以上质粒。

用所获得的质粒转染293细胞，培养48 h后收集细胞培养物，SDS－PAGE电泳进行表达鉴定。电泳确认Vcam－1有表达后继续培养转染的293细胞，7 d后离心收集表达上清。0.45μm滤膜处理上清后，用缓冲液平衡的镍柱纯化上清，收集洗脱产物。洗脱产物透析到PBS溶液中，并浓缩至浓度0.5 mg／m L，即得到纯化的Vcam－1抗原蛋白。

1.2 单链抗体的制备

1.2.1 重组抗体库的筛选 以提取的Vcam－1抗原蛋白包被免疫管，使用鼠源的噬菌体重组抗体天然库（购自上海锐劲生物公司，库容1.5×1010，产物带E－tag标签）在免疫管中实施4轮筛选。4轮筛选中免疫管包被的Vcam－1抗原量递减（依次为10，5，1，0.1μg），PBST（T:0.05%吐温20）洗涤次数增加（依次为7，17，37和37次），经过“吸附－洗脱－扩增”过程将每轮筛选所得的噬菌体置于下一轮筛选条件中，从而使阳性噬菌体得到富集。

1.2.2 阳性克隆的检测 从第4轮筛选的阳性噬菌体所涂布的2×YT－AG平板上随机挑单克隆接种到96孔深孔板，设立空白对照并培养过夜。从该96孔板中分别对应转接20μL至另一含2×YT－A培养液的96孔深孔板，加入辅助噬菌体M13KO7进行噬菌体援救。次日离心取上清进行单噬菌体酶联免疫吸附法（ELISA）检测。

在单噬菌体ELISA实验中，96孔板每孔包被Vcam－1抗原200 ng，并在另一96孔板每孔包被500 ng的牛血清白蛋白（BSA）作为对照。ELISA板经封闭后，每孔加入噬菌体上清，室温下放置2 h。PBST洗涤后，每孔加入抗M13－POD抗体（购自上海锐劲生物公司，1∶5 000稀释），室温下静置1 h。PBST洗涤后，加入底物显色液显色至合适的时间，加终止液终止反应后用酶标仪（BIO－RAD Model－680）读取各孔在450 nm处的吸光度值。取吸光度值大的孔所对应的样品送予测序，并转入大肠埃希菌进行表达，认定高表达的样品为最终的阳性克隆。

1.2.3 单链抗体的表达与纯化 将所得到的阳性克隆质粒热击法转化入感受态细胞HB2151（购自上海锐劲生物公司），诱导抗性基因表达后取单克隆菌落接种至2×YT－AG培养液，至A值为0.5左右时，离心弃上清，用2×YT－AI培养液重悬沉淀，然后30℃培养20 h，离心收集菌体和上清。

取上清进行ELISA检测，确认有单链抗体表达后，接种上述收集的菌体至2×YT－AG培养液，摇菌过夜。次日转接至2 L的2×YT－AG培养液，至A值为0.5左右时离心弃上清，用2×YT－AI培养液重悬沉淀，30℃培养20 h后，离心收集菌体和上清。取15 m L的离子交换柱，用20 mmol／L p H 5.5的磷酸盐缓冲液平衡80 mL后将上清上样，收集流出液并重复上样1次，洗脱后收集90 mL洗脱产物，在透析袋中浓缩至4.2 mg／mL，即得到纯化的单链抗体。

1.3 单链抗体的效价检测

取2个96孔板，每孔包被50 ng的Vcam－1抗原，4℃过夜，PBST冲洗后用BSA室温下封闭2 h。PBST洗涤后第1个板前3排每孔加入100μL稀释的Vcam－1单克隆抗体（购自Abcam公司），以2倍逐级稀释（浓度依次为2、1、0.5……μg／m L），第4、5、6排每孔加入100μL所制备的单链抗体稀释液，以2倍逐级稀释（浓度依次为2、1、0.5……μg／m L），第2个板前3排加入100μL PBS作为对照，37℃温育1 h。PBST冲洗后第1个板前3排加入100μL抗鼠Ig G－HRP二抗（购自Biosharp公司，1∶2 000稀释），第4、5、6排加入100μL抗E－tag－HRP二抗（购自上海锐劲生物公司，1∶2 000稀释），第2个板前3排加入100μL抗鼠IgG－HRP二抗（购自Biosharp公司，1∶2 000稀释），37℃温育1 h。PBST洗涤后加入底物显色液显色至合适的时间，用酶标仪（BIO－RAD Model－680）读取各孔在630 nm处的吸光度值。

舰艇、飞行器和车辆对于核动力装置的空间要求远高于核能发电厂，而传统核聚变反应堆体积、重量很大，远超这些运输工具的体积和重量限制，难以做成适配于这些需求的移动式能量供应源。洛马公司称该堆的体积仅为同功率传统托卡马克装置的1/10，一座直径7米、长18米的该型反应堆就可实现200兆瓦的热功率输出，运行一年所需的燃料量仅为25千克，可以在线补充燃料，无需像裂变堆那样定期停堆更换燃料棒，可连续运行，大幅提升续航能力，而且设计与建造周期也只有数月，成本远低于大型聚变装置。

1.4 统计学分析

单链抗体的效价检测结果表示为均数±标准差形式，各组之间均数比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Vcam－1抗原蛋白的电泳鉴定

Vcam－1基因在293细胞中成功表达，表达上清经纯化后电泳图（图1）未见杂带，所得抗原蛋白分子量为85～90 kD，与文献［4］一致。

图1 293细胞表达Vcam－1抗原蛋白的电泳图Fig.1 Electrophoretogram of Vcam－1 antigen protein in 293 cells

2.2 重组抗体库的筛选滴定

4轮筛选中的噬菌体滴定结果见表1。

表1 筛选噬菌体滴定结果Table 1 Titration result of screened phages

从滴定结果可以看出，随着筛选压力的增加（抗原包被量减少，洗涤次数增加），各轮的回收率仍然显示出增长趋势，并且各轮总的噬菌体回收值维持在较高水平，表明目的噬菌体经过4轮筛选得到了有效富集，可用于单噬菌体ELISA实验。

在Vcam－1抗原包被的96孔（12×8）深孔板中每孔加入经4轮筛选获得的阳性噬菌体克隆孵育，其中设置D7、D8为2×YT－AG培养液空白对照孔，E7、E8为ER2738菌液阴性对照孔，其余各孔为样品孔。各孔经M13－POD抗体孵育并洗涤后用酶标仪测在450 nm处的吸光度值。针对Vcam－1抗原蛋白的单噬菌体ELISA实验结果见表2。

表2 单噬菌体ELISA检测结果Table 2 Results of single phage ELISA

测得D11的DNA序列为:

ATGGCCGAGGTTCAGCTTCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGAAGCCTGGGCAGGGCCTTGAGTGG－ATTGGATATATTAATCCTTACAATGATGGACTAAGTACAATGAGAAGTTCAAAGGCAAGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACCTCTGAGGACTCTGCGGTCTATTACTGTGCAAGATCCTATAGGTACGGTCGATATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGTTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATTGTGCTGACCCAGTCTCCTGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGTACATCTAGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCAAGTATGCATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATACTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTTGGGAGATTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAACGG

2.4 单链抗体纯化的电泳鉴定

取单链抗体的表达上清在离子交换柱上样，收集流出液重复上样一次。上样后用缓冲液（20 mmol／L PB，p H 5.5）冲洗30 m L后用缓冲液（20 mmol／L PB，p H 5.5，电导率7.0 ms／cm）洗脱80 m L，收集洗脱液，然后用缓冲液（20 mmol／L PB，p H 5.5，电导率14.2 ms／cm）洗脱90 m L，收集50 m L目标产物E1和40 m L目标产物E2。二辛可宁酸法（BCA法）测蛋白浓度，E1为0.2 mg／m L。所得样品经电泳后得到结果见图2。

图2 单链抗体表达上清的纯化电泳图Fig.2 Electrophoretogram of supernatant with scFv expression

从电泳图可以看出，表达上清原样及流出液的电泳杂带较多，经过离子交换柱洗脱，目的蛋白得到了纯化，洗脱液E1和E2含杂带少。表达的单链抗体其分子量在30 k D左右，与文献［1］基本一致。

2.5 单链抗体的ELISA效价检测

分别以单链抗体和单克隆抗体作为一抗，用ELISA法检测其对Vcam－1抗原的亲和活性。每组设置6个浓度梯度以2倍逐级稀释（浓度依次为2、1、0.5……μg／m L），且每个浓度设置3个复孔。酶标仪读取各孔吸光度值后计算各复孔的均值和标准差，结果见表3。

在各浓度梯度下单链抗体的效价与单克隆抗体及阴性对照组相比差异均有统计学意义（均P＜0.05）。由此说明，在ELISA检测中单链抗体对Vcam－1抗原蛋白有亲和活性，其效价较单克隆抗体低。

表3 单链抗体与单克隆抗体ELISA检测结果（¯x±s，n＝3）Table 3 ELISA result of sc Fv and monoclonal antibody（¯x±s，n＝3）

3 讨论

抗体是疾病诊断和生物治疗的重要组成部分，抗体的发展经历了多克隆抗体、单克隆抗体和基因工程重组抗体三个阶段。多克隆抗体通过免疫动物提取血清获得，其亲和性可针对不同的抗原决定簇，因此特异性较差。杂交瘤技术制备而成的单克隆抗体特异性强、纯度高，然而杂交瘤细胞的制备和长期培养有可能使其丢失抗体基因，抗体的异源性也使其不适于人体内应用。基因工程重组抗体保留了抗体的特异性抗原识别部位而去除了其他部分，降低了抗体分子大小，也减少了免疫原性，基因工程还可改变重组抗体的生化和免疫特性，增加其亲和性［5］。重组抗体由于分子量小，其组织穿透性和血液清除速度都大大增加，有利于在诊断性显像方面的应用［6］。单链抗体由基因工程将抗体的重链可变区和轻链可变区连接而成，分子量小，可制备成多价（如二价的diabody，三价的triabody，四价的tetrabody）以增加其亲和性［7］，也可连接核素、细胞毒药物、肽、脂类、纳米颗粒等以提供诊断和治疗功能［8］。单链抗体的分子量约为30 k D，肾脏清除的分子量阈值约为60 k D，因此单链抗体可通过肾脏从体内快速清除，在血液的生物半衰期为2～4 h，明显短于完整的免疫球蛋白分子。单链抗体在大肠埃希菌内的大规模生产降低了制备成本［9］，为更多的基础研究和临床应用提供可能。

噬菌体展示筛选方法是获取单链抗体的主要方法。将抗体基因克隆引入到噬菌体载体中可建立不同抗原特异性的抗体文库（库容为108～1012），抗体基因的表达产物融合在噬菌体的外壳蛋白中并展示于噬菌体表面，通过特定抗原对其筛选可得到含有目的抗体基因的克隆，对筛选的克隆进行表达并纯化表达产物即可获得目的抗体。控制筛选条件可改变目的抗体的特性［10］，更大的库容则有助于生成更高亲和力和更加特异的抗体［11］。本实验采用固相筛选的方法经4轮包被抗原递减和洗涤次数增加的“吸附－洗脱－扩增”过程获得了阳性克隆。固相筛选是较为常用的方法，但其不足在于固相化包被可能影响包被抗原的天然构象，不利于筛选出对天然抗原有亲和性的阳性克隆［12］。液相筛选不影响抗原表位，且抗原抗体在液相中自由运动有利于二者相互结合，提高了筛选效率。噬菌体展示筛选获得的抗体具有易于筛选、完全人源、可大量制备及易穿透细胞的特性，可作为人体内的靶向载体。目前，通过噬菌体展示文库筛选的抗体已走向临床［13］，显示了其良好的应用前景。

单链抗体的亲和性改进是自基因工程重组抗体问世以来一直在进行的工作，定向进化是构建大型文库获得高亲和性、良好稳定性抗体的较好方法［14］。未来综合性的基因工程技术将有助于优化重组抗体的亲和性、内化率和稳定性，推动基于重组抗体的纳米颗粒在疾病诊断、治疗方面的应用［15］。本研究通过ELISA方法验证了单链抗体与单克隆抗体的抗原亲和性，单链抗体活性虽不及完整单克隆抗体分子，但已足够用于后期实验研究。

本研究利用噬菌体文库筛选获得了靶向Vcam－1的单链抗体，后期将用核素、荧光分子等标记该单链抗体制备显像探针，示踪Vcam－1介导的粥样硬化易损斑块，用以探究Vcam－1分子在相关病理过程中的作用。该单链抗体的获得为粥样硬化的分子影像评估奠定了基础，有助于克服传统影像技术的诸多不足，为粥样硬化的诊断和治疗提供新的无创方法［16］。

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（2014－09－16 收稿）

Screening scFv Specific to Vcam－1 by Phage Display Library and Its Activity Evaluation

Liu Chunbao，Song Yiling，Zhang Yongxue△
Department of Nuclear Medicine，Union Hospital，Tongji Medical College，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430022，China

Objective To screen out single chain variable fragment antibody（scFv）specific to vascular cell adhesion molecule 1（Vcam－1）from phage recombinant antibody library，and to evaluate its activity and compare its activity with full－length monoclonal antibody.Methods Amplification of Vcam－1 was performed by PCR and Vcam－1 gene plasmid was transferred into eukaryotic cells to express Vcam－1 antigen protein.Immune cuvette was coated with purified Vcam－1 antigen，and the positive clones were screened out by 4 rounds of“adhesion－elution－proliferation”process with gradually increasing pressure.The positive clones were tested by ELISA method and high titer clones were chosen for gene sequencing.Then the high－titer clones were transferred into E.coli，and the clone with the highest expression was regarded as the final requisite one.Competent cells were infected by the final requisite clone and sc Fv was expressed.After purification，the activity of scFv was tested by ELISA and its affinity was evaluated.Results Molecular weight of Vcam－1 antigen protein was 85－90 kD.Positive clones were screened out by taking Vcam－1 protein as the antigen，and 9 high titer clones were obtained by single phage ELISA.Gene sequencing of these clones was carried out and 3 sequences were obtained，1 of which got the highest expression.Molecular weight of the expressed sc Fv was about 30 k D.The sc Fv got high affinity to Vcam－1 antigen according to ELISA，in spite of its lower activity than fulllength monoclonal antibody.Conclusion scFv antibody specific to Vcam－1 was successfully obtained from phage display library，which laid the foundation of subsequent in vivo diagnosis and therapy.

phage display； single chain variable fragment antibody； vascular cell adhesion molecule－1； recombinant antibody

R543.1；R541.4

10.3870／j.issn.1672－0741.2015.04.004

＊国家自然科学基金资助项目（No.81271623）

刘纯宝，男，1986年生，博士研究生，E－mail:chunbao_liu＠sina.com

△通讯作者，Corresponding author，E－mail:zhyx1229＠163.com