毛果算盘子提取工艺及没食子酸含量测定*

黄红泓，甄汉深，柳贤福

(1.广西中医药大学赛恩斯新医药学院，南宁 530222；2.广西中医药大学药学院，南宁 530001)

毛果算盘子提取工艺及没食子酸含量测定*

黄红泓1，甄汉深2，柳贤福1

(1.广西中医药大学赛恩斯新医药学院，南宁 530222；2.广西中医药大学药学院，南宁 530001)

目的 建立测定广西不同产地毛果算盘子中没食子酸含量的高效液相色谱(HPLC)法。方法 采用正交实验优化毛果算盘子的提取工艺，用HPLC法测定毛果算盘子中没食子酸的含量。色谱柱为Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液(10：90)，检测波长为270 nm，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃。结果 没食子酸在0.031～0.186 μg呈良好的线性关系(r=0.999 9)，平均加样回收率为102.81%，RSD为2.05%(n=9)。结论 所建立的方法简单、稳定、重复性好，可用于毛果算盘子药材的质量控制。

毛果算盘子；没食子酸；提取工艺；含量测定；色谱法，高效液相

毛果算盘子为大戟科植物毛果算盘子(GlochidioneriocarpumChamp.)的干燥地上部分，别名毛七公、漆大伯、两面毛、漆大姑。味苦、涩，性平，全年可采收。具有驱风利湿、散瘀、止血、消肿的功效，用于急性胃肠炎、痢疾、风湿性关节痛、跌打损伤、创伤出血、湿疹、漆疮、皮炎等的治疗[1]。其含有酚类、鞣质类[1-3]和三萜类化合物，以及微量元素。韦松基等[4]对毛果算盘子和算盘子的显微特征进行了比较研究。刘布鸣等[5-6]采用薄层色谱研究表明，漆大姑药材与没食子酸对照品色谱在相应的位置上显相同颜色斑点，并从漆大姑中分离出没食子酸类化合物。

已有文献证实没食子酸具有抗炎、抗突变、抗氧化等多种生物学活性[7]，对血管亦有收缩作用[8]。没食子酸为毛果算盘子主要成分之一，其生物学活性与文献记载的毛果算盘子功效相似，故选择没食子酸成分为含量测定指标。目前文献报道只有用薄层扫描法测定漆大姑中没食子酸的含量，笔者尚未见高效液相色谱(HPLC)法测定的报道。因此，笔者在本实验中建立毛果算盘子中没食子酸的HPLC测定方法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 安捷伦Agilent1200高效液相色谱仪，可变波长检测器(G-1313A)。LG16-W高速微量离心机(北京医用离心机厂)，SB3200T超声波清洗仪(上海能信超声有限公司)，Millipore Simplicity-185超纯水仪(美国密里博公司)，BP211D电子分析天平(德国赛多利斯，精度：0.01 mg)。

1.2 试药 没食子酸(中国食品药品检定研究院，批号：110831-200803，供含量测定)。甲醇(美国Fisher科学世界公司，批号：A372-4)、乙腈为色谱纯(美国Fisher科学世界公司，批号：A943-4)，其余试剂为分析纯(北京化工厂)。毛果算盘子药材于2012年4月采自广西10个地区，分别经广西中医药大学药学院中药鉴定教研室宁小清副教授及广西中医药大学赛恩斯新医药学院生药教研室苑敏副教授鉴定，均为大戟科植物毛果算盘子(GlochidioneriocarpumChamp.)的干燥地上部分(表1)。标本存放于广西中医药大学赛恩斯新医药学院标本室。

表1 毛果算盘子药材编号与产地

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Hypersil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.2%磷酸溶液(10：90)；检测波长270 nm；流速为1.0 mL·min-1。柱温20 ℃；进样量5 μL。

2.2 溶液的制备 取105 ℃干燥至恒重的没食子酸对照品1.55 mg，精密称定，置25 mL量瓶，加甲醇适量使溶解并定容，摇匀，即得浓度为0.062 mg·mL-1没食子酸对照品溶液。取毛果算盘子药材粉末约1 g，精密称定，精密加入甲醇40 mL，称重，静置12 h，超声提取40 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液于离心管，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液5 μL，注入液相色谱仪测定，即得。

2.3 专属性实验 分别精密吸取上述没食子酸对照品溶液和毛果算盘子供试品溶液各5 μL进样分析，结果见图1。没食子酸的保留时间为6.0 min，与各自相邻峰的分离度>1.5。

1.没食子酸

图1 没食子酸对照品(A)和毛果算盘子样品(B)HPLC色谱图

2.4 供试品处理的正交实验 根据没食子酸的性质及初步预实验结果，采用正交实验L9(34)进行毛果算盘子的甲醇超声提取工艺研究，以没食子酸的含量为评价指标，正交设计表及分析结果见表2～4。

表2 正交设计因素水平表

A：甲醇浓度，B：甲醇用量，C：提取时间

因素极差R越大，说明因素的水平改变对实验结果影响越大。由实验结果的直观分析及方差分析可知，影响没食子酸提取效果的因素大小顺序为A>B>C，即甲醇浓度>甲醇用量>提取时间，其中甲醇浓度和甲醇用量对实验结果有显著性影响，根据实验结果确定最佳提取方法为A3B3C2，即用100%甲醇40 mL超声处理40 min。

表3 没食子酸L9(34)正交实验表与结果

A：甲醇浓度，B：甲醇用量，C：提取时间

为进一步考察优选工艺的可靠性和稳定性，取3份S1号样品粉末，按上述最优工艺条件A3B3C2进行验证实验，按“1.2.1”项所述方法进行测定，结果没食子酸含量为0.93，0.91，0.89 mg·g-1。平均含量0.91 mg·g-1，RSD=1.98%。与正交实验方案中的最高值相同，说明优化成功。

表4 没食子酸方差分析表

A：甲醇浓度，B：甲醇用量，C：提取时间

2.5 线性关系考察 精密吸取“2.2”项对照品溶液1，2，3，4，5，6 mL，分别置于10 mL量瓶中，加入甲醇定容，摇匀，分别取上述6个不同浓度的对照溶液5 μL注入高效液相色谱仪，按“2.4”项色谱条件测定其峰面积。以对照品溶液进样量(μg)为横坐标，其色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，得出没食子酸回归方程为Y=3 090.8X+1.0，r=0.999 9；结果表明没食子酸在进样量为0.031～0.186 μg之间呈良好的线性关系。

2.6 精密度实验 精密吸取S1供试品溶液5 μL，注入高效液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件，连续进样6次，测定样品中没食子酸的峰面积。结果测得样品中没食子酸峰面积RSD为1.09%，表明所用液相色谱仪的精密度较好。

2.7 重复性实验 取S1毛果算盘子药材粉末1 g，精密称定，共取6份，按“2.2”项供试品制备方法制备， 精密吸取供试品溶液5 μL，按“2.1”项色谱条件进行测定，计算没食子酸含量，RSD为2.02%。结果表明，用上述方法测定没食子酸的含量，重复性好。

2.8 稳定性实验 取S1毛果算盘子药材粗粉约1 g，精密称定，按“2.2”项供试品制备方法制备，室温下保存，分别在0，2，6，10，16，24 h精密吸取供试品溶液5 μL，注入液相色谱仪，按“2.1”项色谱条件测定，考察稳定性。结果测得样品中没食子酸峰面积RSD值为1.47%，表明供试品溶液在24 h内保持稳定。

2.9 加样回收率实验 取已知含量S1号样品粉末约0.5 g，精密称定，精密加入甲醇40 mL，精密加入没食子酸0.37，0.45，0.56 mg(加入量为样品含量的80%，100%和120%)。按“2.2”项供试品制备方法制备，各平行制备3份，分别测定含量，计算加样回收率(毛果算盘子药材没食子酸含量以0.91 mg·g-1计)，结果见表5。实验结果可知，没食子酸的平均加样回收率为102.81%，RSD=2.05%。

表5 毛果算盘子加样回收实验结果n=9

2.10 样品测定 分别取广西不同产地(2012年4月份采收)毛果算盘子药材粉末(每个产地各3份)约1 g，精密称定，精密加入甲醇40 mL，称质量，静置12 h，超声提取40 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液于离心管，12 000 r·min-1离心10 min，取上清液5 μL，注入液相色谱仪测定，即得。用标准曲线法计算，实验结果见表6。

表6 不同产地毛果算盘子药材含量测定结果n=3

3 讨论

笔者在本实验中采用HPLC法测定毛果算盘子中没食子酸的含量，该方法简单，质量控制方法切实可行，可在一定程度上反映毛果算盘子药材的质量。

不同产地的毛果算盘子中的没食子酸含量差异较大。从不同产地毛果算盘子药材含量测定结果可以看出，1，7号产地的毛果算盘子中没食子酸的含量较高。

本文在前期单因素考察实验中发现，甲醇的浓度越高提取效果越好，在50%甲醇提取条件下，提取效果并不佳。而在甲醇达到80%才能达到一定的提取效果，且每上一个10%浓度梯度，提取的效果存在显著差异。本实验设定了甲醇80%，90%，100%3个浓度进行正交实验，结果显示100%甲醇提取效果最佳，且甲醇浓度对实验结果影响差异有统计学意义。

[1] 江苏新医学院.中药大词典(下册)[M].上海：上海人民出版社，1977：2574.

[2] 广州市药品检验所.农村中草药制剂技术[M].北京：人民卫生出版社，1971：233.

[3] 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准(第2册)[M].南京：广西科学技术出版社，1996：281.

[4] 韦松基，陈建霞，韩剑.毛果算盘子与算盘子的显微鉴别[J].广西中医药，2007，30(1)：59-60.

[5] 刘布鸣，陈荣光，韦汝武，等.漆大姑中没食子酸的分离鉴定与薄层色谱鉴别[J].广西科学，1999， 6 (3)： 203-204.

[6] 刘布鸣，陈荣光，蔡全玲.漆大姑化学成分的初步研究[J].广西中医药，2000， 23(1)：52-54.

[7] 李肖玲，崔岚，祝德秋.没食子酸生物学作用的研究进展[J].中国药师，2004，7(10)：767-769.

[8] YOSHINO M，HANEDA M，NARUSE M，et al.Prooxidant action of gallic acid compounds： copper-dependent strand breaks and the formation of 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine in DNA[J].Toxicol In Vitro，2002，16(6)：705-709.

DOI 10.3870/yydb.2015.03.029

2014-01-21

2014-02-15

*广西高校科学资助项目(LX2014668)

黄红泓(1977-)，女，广西梧州人，讲师，硕士，从事药学和中药学教学和科研工作。电话：0771-4736399，E-mail：929762704@qq.com。

R286；R927.1

B

1004-0781(2015)03-0392-03