促肝细胞再生磷酸酶-3及整合素β1在食管鳞状细胞癌中的表达及意义

陈 星，成争艳，王 凯，孙明伟

(四川省医学科学院·四川省人民医院城东病区 a.创伤外科，b.病理科，四川 成都 610101)

促肝细胞再生磷酸酶-3及整合素β1在食管鳞状细胞癌中的表达及意义

陈 星a，成争艳b，王 凯a，孙明伟a

(四川省医学科学院·四川省人民医院城东病区 a.创伤外科，b.病理科，四川 成都 610101)

目的 探讨促肝细胞再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3)及整合素β1(integrinβ1，Intβ1)在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床意义。方法 采用免疫组织化学法和实时荧光定量PCR检测食管癌组织、癌旁组织和正常组织中PRL-3 和Intβ1的表达水平。结果 在蛋白水平和基因水平检测均发现癌组织中PRL-3 和Intβ1的表达高于癌旁组织(P< 0.05)和正常组织。结论 PRL-3 和Intβ1在食管鳞状细胞癌组织中表达增高，可能作为肿瘤标志物来监控食管鳞状细胞癌的发生、发展、浸润和转移。

食管鳞状细胞癌；促肝细胞再生磷酸酶3；整合素β1

食管癌世界标准化死亡率为23.40/10万，占各种癌症死亡的23.53%，仅次于肺癌、胃癌，居第三位[1]。。但是其发病的分子机制仍不清楚[2]。促肝细胞再生磷酸酶-3(phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3)有促进细胞的生长、迁移和浸润的作用[3]，特别是在肿瘤的转移中起关键作用。整合素β1(integrinβ1，Intβ1)可使细胞间的黏附能力下降[4]，从而促进肿瘤组织的浸润转移。目前PRL-3及Intβ1与食管癌的关系研究较少，而两者在食管癌中基因和蛋白水平的定量分析及两者的相关性在国内鲜有报道。本研究采用免疫组织化学法和实时荧光定量PCR检测PRL-3及Intβ1在食管癌组织、癌旁组织和正常组织中的表达，观察其在食管癌发生、发展、黏附和浸润转移中的作用，为临床预测食管癌转移潜能和预后及治疗提供客观有效的指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料 用于免疫组化检测的40例食管鳞状细胞癌组织来源于我院病理科2010年1月至2013年12月胸外科手术切除标本。其中高分化鳞状细胞癌20例，中分化鳞状细胞癌13例，低分化鳞状细胞癌7例。并且取相应的癌旁组织(距肿瘤边缘1.0 cm处黏膜组织)及正常组织(距肿瘤边缘5.0 cm处黏膜组织，经镜下观察未发现癌细胞)。用于Real-time PCR的12例新鲜食管癌组织、癌旁组织及正常组织取自2012年1月至2013年11月我院胸外科手术切除标本。其中高分化鳞状细胞癌5例，中分化鳞状细胞癌4例，低分化鳞状细胞癌3例。所有患者术前均未接受任何治疗，平均年龄61.2岁(45～76岁)。12例新鲜组织切除后立即放入-70 ℃冰箱保存备用。

1.2 免疫组化 按照免疫组化二步法检测试剂盒说明进行操作，测定PRL-3和 Intβ1的表达。切片常规脱蜡至水，高压抗原修复，PRL-3单克隆抗体及Intβ1单克隆抗体(美国Santa Cruz公司鼠抗人)4 ℃孵育过夜，DAB显色，苏木素复染。用PBS代替一抗作为阴性对照。在高倍镜下观察切片，随机选取5～6个视野拍照，结果采用Image Pro 6.0图像分析系统分析，测量平均光密度值(IOD)，各组进行比较。

1.3 实时荧光定量PCR

1.3.1 总RNA的提取 ①组织匀浆后加0.2 ml氯仿，剧烈摇荡离心管15 s，室温放置3 min后12 000 r/min 4 ℃离心10 min；②取上层水于新的离心管，加等体积异丙醇混匀，室温放置10 min；③ 12 000 r/min离心10 min，弃上清液并以75%乙醇洗涤沉淀；④离心弃上清液后室温干燥10 min，加50 μl RNase-free ddH2O充分溶解RNA备用。

1.3.2 cDNA的合成 取总RNA 500 ng进行逆转录，用美国Bio-Rad公司iScriptTM cDNA Synthesis Kit试剂盒，总体系10 μl：5×PrimeScript Buffer 2 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix 10.5 μl，Oligo dT Primer(50 μmol/L)0.5 μl，Random 6 mers(100 μmol/L)0.5 μl，补DEPC水至10 μl；上PCR仪反转录，37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。

1.3.3 PCR扩增 引物序列如下：PRL-3上游引物5′-GGGACTTCTCAGGTCGTG TC-3′，下游引物5′-AGCCCCGTACTTCTTCAGGT-3′。Intβ1上游引物5′-ACGAGGTCATGGTTCATGTTG-3′，下游引物5′-CCTCATACTTCGGATTG ACCA-3′。GAPDH上游引物5′-ATGCTGGCGCTGAGTACGTC-3′，下游引物5′-GGTCATGAGTCCTTCCACGATA-3′。引物由上海生工合成，用大连宝生物TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒，反应体系25 μl。其中cDNA 2 μl，SYBR Premix Ex Taq(2×)12.5 μl，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.5 μl，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.5 μl，dH2O 9.5 μl。将各反应管放入定量PCR仪器的反应槽内，循环条件：①95 ℃预变性10s后开始循环；②95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。检测样本PRL-3和 Intβ1的Ct值。根据其Ct值，用软件ABI StepOne，按公式2-△△Ct计算出相对表达量，各组进行比较。

1.4 统计学方法 应用软件包SPSS 17.0进行统计学分析。数据以均数±标准差表示；各组内表达的差异应用重复测量的方差分析对数据进行分析，P< 0.05为差异有统计学意义。用Pearson相关分析检验相关性，P< 0.05为有相关性。

2 结果

2.1 PRL-3及Intβ1蛋白表达水平与阳性细胞定位 40例食管癌组织中PRL-3阳性27例(67.5%)，Intβ1阳性29例(72.5%)的癌细胞胞质中出现浅黄色至棕褐色颗粒样物，间质无着色(图1a、图2a)；相应的癌旁组织中PRL-3阳性表达15例(37.5%)，且阳性细胞均集中在不典型增生区域的细胞质中(图1b)，Intβ1阳性表达16例(40%)(图2b)；正常组织中PRL-3散在阳性13例(32.5%)(图1c)，Intβ1散在阳性15例(37.5%)(图2c)。PRL-3在癌组织、癌旁组织及正常组织中的IOD值依次降低，差异有统计学意义(P< 0.01)。Intβ1在癌组织中IOD值高于癌旁组织及正常组织IOD值，差异有统计学意义(P< 0.01)，见表1。

图1 PRL-3的表达 a：癌组织；b：癌旁组织；c：正常组织(×400) 图2 Intβ1的表达 a：癌组织；b：癌旁组织；c：正常组织(×400)

组织类型nPRL-3Intβ1癌组织400.185±0.004*0.187±0.003*癌旁组织400.179±0.0060.180±0.004正常组织400.173±0.0040.179±0.004

与癌旁组织及正常组织比较，*P<0.01

2.2 PRL-3和Intβ1的基因表达水平 PRL-3 mRNA在癌组织中相对表达量明显高于癌旁组织及正常组织，差异有统计学意义(P< 0.01)。Intβ1 mRNA在癌组织、癌旁组织及正常组织中的相对表达量也依次降低，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。

表2 食管癌中PRL-3和 Intβ1基因表达 (%)

与癌旁组织及正常组织比较，*P<0.01

2.3 PRL-3和Intβ1表达的相关性 在蛋白表达水平，癌组织中PRL-3 和Intβ1表达呈正相关关系(r=0.412，P= 0.024)，癌旁组织中PRL-3和Intβ1表达亦呈正相关关系(r=0.446，P= 0.049)。在基因表达水平，癌组织及癌旁组织中PRL-3 与Intβ1表达均无相关性(r=-0.349，r=-0.137，P> 0.05)。

3 讨论

PRL属于酪氨酸蛋白磷酸酶家族成员，包括PRL-1、PRL-2、 PRL-3。PRL在正常组织中有不同程度的表达，但更多研究表明其与肿瘤细胞转移密切相关[5，6]。目前已发现PRL-3在胃癌、卵巢癌、结直肠癌，肝癌的发生、侵袭、转移中起重要作用[7～9]。PRL-3可通过调节酪氨酸的磷酸化和去磷酸化，进而调节细胞的生长、分化、信息传递等活动。同时PRL-3可通过激活细胞内的Rho、MAPK信号通路使细胞增殖和分化，提高浸润转移能力[10]。本实验在蛋白和基因水平检测了PRL-3 在正常食管黏膜组织、食管鳞状细胞癌原发灶及癌旁组织中的表达情况，结果表明在食管鳞状细胞癌中PRL-3 蛋白和基因在原发灶中的表达明显高于癌旁组织，说明高表达的PRL-3 可能在食管鳞状细胞癌发生转移中起作用。

整合素是黏附分子五大家族成员之一，对细胞及其外基质的黏附起主要介导作用[11]。Intβ1是介导ECM信号的主要细胞表面受体，与其配体相结合可以促进细胞的黏附、增殖和迁移等作用。研究表明，Intβ1与多种肿瘤细胞的增殖、侵袭转移有密切关系[12，13]。本实验检测了Intβ1在蛋白和基因水平的表达情况，结果表明在食管鳞状细胞癌中Intβ1 蛋白和基因在原发灶中的表达明显高于癌旁组织，证明了Intβ1的高表达可能与食管鳞状细胞癌黏附及侵袭增强有关。

PRL-3和Intβ1各种细胞外信号传递至细胞内主要依靠MAPK通路介导[14]，有研究显示PRL-3可通过正调控PRL-3-整合素β1-ERK1/2-MMP-2信号传导通路[15]增强Intβ1的表达，使肿瘤组织的活动性、侵袭性和转移能力增强。本实验结果显示，在蛋白表达水平癌组织和癌旁组织中PRL-3 和Intβ1表达均呈正相关关系，说明其机制PRL-3可能通过活化通路提高Intβ1表达，从而增强细胞间质侵袭转移的能力。在基因表达水平PRL-3 和Intβ1表达无相关性，可能由于mRNA翻译成蛋白的滞后性及mRNA转录后调控机制的影响。综上所述，PRL-3和Intβ1在食管鳞状细胞癌中高表达，且在食管鳞状细胞癌的发生、发展、浸润和转移起关键作用，可能作为肿瘤标志物来监测肿瘤、判断预后，也有望成为治疗肿瘤的靶点。

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Expression and significance of phosphatase of regenerating liver-3 and integrinβ1 in esophageal squamous cell carcinoma

CHENXinga，CHENGZheng-yanb，WANGKaia，SUNMing-weia

(a.DepartmentofThoracicSurgery，b.PathologyDepartment，EasternDistrict，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610101，China)

SUNMing-wei

Objective To investigate the expression and significance of phosphatase of regenerating liver-3(PRL-3)and integrinβ1(Intβ1)in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC).Methods The expression of PRL-3 and Intβ1 in esophageal squamous cell carcinoma，adjacent non-tumor tissues and normal esophageal tissues were detected by using an immunohistochemical analysis and a real-time PCR analysis.Results The mRNA and protein expressions of PRL-3 and Intβ1 were higher in the esophageal squamous cell carcinoma than that in the adjacent non-tumor tissues(P< 0.05).The lowest expressions of the two factors were found in the normal esophageal tissues.Conclusion PRL-3 and Intβ1 may be used as tumor markers in progression，invasion and metastasis of the disease.

Esophageal squamous cell carcinoma；Phosphatase of regenerating liver-3；Integrin β1

四川省卫生厅2013年科研项目(编号：130142)

孙明伟

R735.1；R365

A

1672-6170(2015)01-0049-03

2014-09-17；

20104-11-04)