不同金属离子和pH对白腐菌Ganoderma lucidum产漆酶的影响

卞 丹，求璐慧，杨海龙

(温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035)

不同金属离子和pH对白腐菌Ganoderma lucidum产漆酶的影响

卞 丹，求璐慧，杨海龙†

(温州大学生命与环境科学学院，浙江温州 325035)

在发酵培养基中添加不同浓度金属离子，研究Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+和Fe2+等金属离子的浓度和pH对白腐菌Ganoderma lucidum生产漆酶的影响．结果表明：Zn2+、Cu2+和Mn2+对G. lucidum生产漆酶有不同程度促进作用，其中Cu2+的促进作用最大，Mg2+在高浓度时促进产酶，Fe2+则抑制漆酶的生产；pH为5时最利于漆酶的生产，酶活可达到140 000 U/L．

白腐菌；金属离子；pH；漆酶

漆酶（Laccase）是一种结合4个铜离子的多酚氧化酶，其中Cu2+与酶以配位体的形式结合．在催化反应过程中，氧分子被还原为水，而漆酶从氧化底物分子中提取一个电子，使之形成自由基，该自由基不稳定，可自身结合或者相互偶联，形成聚合物或偶联物，此过程中不产生其他物质[1]．漆酶可与多酚、木质素、甾体等多种底物发生反应[2]，故在木质素降解、生物制浆与漂白、染料的脱色、生物监测等方面有着广泛的应用[3-4]．漆酶主要分布于真菌、高等植物，在众多生产漆酶的生物体中，白腐菌Ganoderma lucidum是最主要的生产者[1]．

目前，由于生产效率不高等原因，漆酶还未实现工业化大规模生产，如何提高漆酶产量与活力等问题尚在探索中．许多研究发现[5-7]金属离子和pH对微生物产酶有重要影响，本研究以白腐菌Ganoderma lucidum WZ-32为生产菌，通过改变金属离子浓度和pH来探究其对产酶的影响，以期优化G. lucidum WZ-32生产漆酶的培养条件，为漆酶的大规模工业化生产提供依据．

1 材料与方法

1.1 菌 种

供试白腐菌G. lucidum WZ-32为温州大学生命与环境科学学院发酵工程实验室提供，菌种接种于PDA斜面培养基上培养5 d，4℃保存．

1.2 主要试剂与仪器

2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐（简称ABTS）购自美国Sigma公司，柠檬酸、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸铜、硫酸锰、硫酸亚铁、氢氧化钠、盐酸等试剂均为市售分析纯．

LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；Mettler-Toledo SevenEasy pH计（梅特勒-托利多仪器有限公司）；TU-1810型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；ZHWY-2112B恒温培养振荡器（上海智诚分析仪器制造有限公司）；VS-840K-U洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）．

1.3 漆酶发酵液的制备

将白腐菌G. lucidum WZ-32接种于100 mL种子培养基（葡萄糖2%，玉米粉2%，豆粕1%，硫酸镁0.075%，磷酸氢二钾0.15%，水，pH自然），在28℃、165 r/min摇床培养5 d．将种子液按10%的接种量接种到150 mL的发酵培养基中（葡萄糖1%，玉米粉2%，豆粕1%，花生壳2%，硫酸镁0.075%，磷酸氢二钾0.075%，磷酸二氢钾0.075%，水，pH自然），在28℃、165 r/min恒温摇床培养5 d．发酵液常温下滤纸过滤取其上清，适当稀释测定漆酶活性．

1.4 漆酶测定方法

本实验采用分光光度法[8]测定漆酶活力．反应总体系3 mL，含0.1 mL稀释酶液，1.9 mL pH=3.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液和1.0 mL 0.5 mmol/L ABTS溶液．45℃水浴保温3 min，于420 nm处测定吸光值，实验重复3次，取平均值．每分钟氧化1μmol底物所需要的酶量为1个酶活单位（U）．空白对照组中以蒸馏水代替酶液．

1.5 金属离子对产酶的影响

在发酵培养基中加入①本文实验所涉及浓度均为重量百分浓度(w/v).0.06%的不同金属离子（Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+和Fe2+），摇床培养5 d测其酶活．

1.6 金属离子浓度对产酶的影响

在发酵培养基中依次加入0、0.01%、0.02%、0.04%、0.06%和0.1%的金属离子（Zn2+、Cu2+、Mn2+和Fe2+），摇床培养5 d测其酶活．添加Mg2+时浓度分别为为0、0.025%、0.05%、0.075%、0.1%和0.125%．

1.7 pH对产酶的影响

将灭菌后的发酵培养液pH依次调节到4、4.5、5、5.5、6、6.5、7和7.5，摇床培养5 d测其酶活．

2 结果与讨论

2.1 不同金属离子对产酶的影响

金属离子对漆酶的影响是多方面的，离子种类、离子电荷数和离子浓度等都会对酶的活性产生不一样的影响[9]．在发酵培养基中分别加入0.06%的不同金属离子，摇床培养5 d测其酶活，探究不同金属离子对G. lucidum WZ-32产酶的影响，结果见表1．

表1 不同金属离子对产酶的影响

表1显示，同等浓度下，Zn2+、Cu2+、Mn2+对产酶有不同程度的促进作用．在这三者中，Cu2+对产酶影响最大，漆酶活力显著提高，Mg2+和Fe2+对漆酶活性有些许抑制作用．

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，铜是漆酶蛋白质的结构组成，因此它的存在能有效提高真菌漆酶的产量．Collins P. J.[10]和Galhaup C.[11]等学者认为可能是铜离子能够诱导漆酶基因转录合成蛋白，所以缺少和限制铜含量都会不利于漆酶的合成．Stajic M.等[12]研究发现Cu2+和Mn2+对侧耳属的三种菌有不同的促进作用．Zn2+、Cu2+、Mn2+易与漆酶芳香基上的羰基、羧酸残基结合，改变漆酶中心离子的结构，从而表现激活作用[5]．Fe2+通过与底物催化氧化产物ABTS自由基的反应来抑制漆酶的活力[13]．金属离子作为发酵培养基中的微量元素，对菌体的生长和相关代谢物的合成有重要影响．

2.2 金属离子浓度对产酶的影响

不同金属离子及浓度对产酶的影响见表2．

表2 不同金属离子及浓度对产酶的影响

表2的结果显示了不同金属离子浓度对产酶的影响，其中Zn2+、Cu2+和Mn2+对G. lucidum生产漆酶有不同程度促进作用，Fe2+则抑制漆酶的生产．由表2可以看出，Zn2+在其浓度小于0.1%时，对产酶影响表现为促进作用；且在浓度为0.06%时达到最大酶活，大约是对照组漆酶活性的2倍．Cu2+极大的促进了漆酶的产量，当培养基中Cu2+浓度为0.02%时漆酶活性最大，达42 014.35 U/L，大约是对照组漆酶活性的27倍，大大提升漆酶产量．因此在漆酶生产过程中可添加适量的Cu2+离子，以达到高产的效果．Stajic M.等[12]的研究也表明Cu2+的不同浓度使侧耳属三种菌种的漆酶活性得到不同程度的提高．实验范围内不同的Mn2+浓度对漆酶产量的促进作用不明显，较高浓度的Mg2+可促进G. lucidum WZ-32生产漆酶．Fe2+对漆酶的生产情况具有明显的抑制作用，并且这种抑制作用随着浓度的增加而轻微增强．

2.3 pH对产酶的影响

漆酶是蛋白质，并且是两性电解质，因此其在发酵培养基中的解离程度受H+的影响，即培养基的pH对产酶有明显影响．研究表明[14]过多的H+会影响漆酶活性中心结合集团的解离状态，从而使得漆酶不能催化底物，还可能影响底物的解离状态，使底物不能与漆酶结合，从而阻止催化反应进行．刘尚旭等[15]对糙皮侧耳Ax3产漆酶条件进行研究，发现其最适pH为5.5．赵凤霞等[9]对白腐菌Trametes pubescens MB89产漆酶发酵条件进行优化探究，最终得出在不同底物影响下，产酶的最适pH不同．pH对漆酶活性的影响见图1．

图1 pH对漆酶活性的影响

图1表明G. lucidum WZ-32产酶情况易受pH影响，且随着pH变动产酶变化较大．当发酵培养基的pH为5，其产量最大，为140 000 U/L．当pH在4.0 – 5.0之间时，漆酶产量随着pH的增大而快速提高，而当pH＞5.0时，漆酶产量随着pH的增大而降低．这说明初始的pH条件对G. lucidum WZ-32生产漆酶具有重要影响，适当的酸性条件能促进它的代谢作用，产生更多漆酶．

3 结 论

Zn2+，Cu2+，Mn2+，Mg2+和Fe2+等金属离子对白腐菌G. lucidum WZ-32产酶影响不同，研究表明Zn2+、Cu2+和Mn2+对漆酶活性都有不同程度的促进作用，其中Cu2+对产酶的促进作用最大．当培养基中Cu2+浓度为0.02%时，漆酶活力最大，为42 014 U/L．Mg2+在高浓度时促进产酶，而Fe2+则完全抑制漆酶的生产，降低漆酶产量．此外，漆酶活性受pH变化影响较大，当pH为5.0时，活性最大，达140 000 U/L，也说明适当的酸性条件更能促进G. lucidum WZ-32生产漆酶．

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Effects of Diverse Metal Ions and pH on Laccase Production of Ganoderma Lucidum

BIAN Dan, QIU Luhui, YANG Hailong
(School of Life and Environmental Science, Wenzhou University, Wenzhou, China 325035)

This paper probes into the effects of metal ions with diverse concentration on laccase production in the submerged culture of Ganoderma lucidum via addition of Zn2+, Cu2+, Mn2+, Mg2+and Fe2+respectively in the fermentation media. The results indicate that the laccase production is accelerated at different degrees by the addition of Zn2+, Cu2+and Mn2+, among which Cu2+has the most promoting effect. While, Mg2+accelerates the laccase production at high concentration, but Fe2+has inhibitive effect on the laccase production. The effect of pH on the laccase production is also researched. When the pH value is set at 5, the enzyme activity reaches 140, 000 U/L, which is the best for the production of laccase.

Ganoderma lucidum; Metal ion; pH; Laccase

Q815

A

1674-3563(2015)02-0058-05

10.3875/j.issn.1674-3563.2015.02.009 本文的PDF文件可以从xuebao.wzu.edu.cn获得

(编辑：封毅)

2014-05-12

卞丹(1992- )，女，浙江慈溪人，研究方向：生物技术．† 通讯作者，yhl@wzu.edu.cn