基于线粒体DNA多态性鉴定烟台海鲜市场鱼种

于卫霞，刘晓玲，王敏强，赵明日，王家璇

(1.烟台大学生命科学学院，山东烟台264005;2.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014)

基于线粒体DNA多态性鉴定烟台海鲜市场鱼种

于卫霞1，刘晓玲1，王敏强1，赵明日1，王家璇2

(1.烟台大学生命科学学院，山东烟台264005;2.山东师范大学生命科学学院，山东济南250014)

由烟台海鲜市场随机采集具有相对重要商业价值的10种海鱼(小黄鱼、牙片、鲅鱼、面条鱼、鲐鱼、鲳鱼、鲈鱼、偏口、黑鱼、白姑鱼)，利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术对鱼种进行鉴定.首先提取10种海鱼的基因组DNA，利用自行设计的通用引物对其线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因(MT-co3)进行PCR扩增，对扩增产物克隆、测序，用NCBI数据库检索，确定了10种海鱼的鱼种.依据测序结果进行限制性内切酶酶切分析，选用NlaⅢ和HinfⅠ2种内切酶进行酶切，获得了各种鱼类特异的酶切片段图谱.研究结果表明，PCR-RFLP能有效地区分以上10种海鱼，在鱼种鉴定上具有简便、准确的优势，可为鱼类食品检测提供科学依据.

聚合梅链式反应-限制性片段长度多态性技术;物种鉴定;线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因;海鱼

近年来，在海鱼产品捕捞、加工处理、市场流通等环节中，以次充好、鱼种标签混乱等问题几乎成为一个全球性的普遍现象［1-3］.在生活实践中，人们一般依据形态特征等对鱼种进行鉴别［4］，但经过加工尤其是深加工的产品则难以辨别其种类来源;而且由于所处生态环境、食物种类等方面的差异也可能造成鱼类形态学上的差异，所以完全通过形态学进行种属的鉴别非常困难［5-6］.目前对海洋食品物种鉴定方法主要有2种，一种是蛋白质鉴定方法，另一种是基于DNA技术的分子生物学方法.相对于用蛋白质对物种进行鉴定，利用DNA技术进行鉴定具有更高的特异性和灵敏度的可靠性［7］.该技术突破了对经验和专业知识背景的过度依赖，即便是对有机体残片也可以进行快速有效的鉴定.在DNA技术的分子生物学方法中，线粒体DNA(mtDNA)以其分子结构简单、母系遗传、进化速度快、具有更好的耐热性和相对高的丰度等成为海洋食品物种鉴定中首选［8］，其中应用最为普遍的是细胞色素b基因(cyt b)，其次是16S rRNA和12S rRNA;在常用的分析技术中，列前2位的是PCR-RFLP和PCR-sequencing［9］.Hebert等［10-11］提出利用线粒体细胞色素C氧化酶I亚基(MT-co1)的特定区段做DNA条形编码(DNA barcoding)的基础，确定了其在动物鉴定中的作用.Wolf等［12］利用PCR-RFLP鉴别出10种鲟鱼中的8种;Haye等［13］利用MT-co1对智利市场上7种螃蟹制品进行鉴别，发现一种螃蟹制品与其商品标签不符;李潇等［7］用PCR-RFLP和芯片生物分析技术，通过扩增cyt b基因片段，并用DdeⅠ、HaeⅢ和NlaⅢ3种限制性内切酶酶切分析，对渤海湾鱼种进行了鉴定;陈双雄等［14］也用PCR-RFLP和芯片生物分析技术，通过对扩增cyt b基因片段的DdeⅠ、HaeⅢ和NlaⅢ3种酶切图谱分析，鉴定了台湾海峡常见8种石斑鱼品种和5种鲷鱼品种;李新光等［15］以MT-co1基因为研究对象，采用基因克隆技术和生物信息学技术对市场上购买的冷冻鱼、冻鱼片和烤鱼片进行了鉴别.

本研究从GenBank数据库中获得不同鱼种的线粒体细胞色素C氧化酶Ⅲ基因(cytochrome c oxidase subunitⅢ，MT-co3)及其旁侧序列，通过比对分析，设计一对通用引物扩增各种海鱼该基因，利用生物信息学技术、基因克隆、测序与PCR-RFLP技术对海鱼种类进行鉴别，旨在建立简便、准确、高效的鱼肉制品的鉴定方法，为鱼肉制品的溯源和安全监管提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 材料

于2013年5月和2014年5月，分别从烟台市红利市场和清泉寨市场购买10种海鱼，分别编号为1～10，每种鱼随机选取5尾，其本地的中文俗名见表1.每尾鱼均经形态学鉴定后，取其背部肌肉组织保存于75%的乙醇中备用.

表110 种海鱼样品Tab.1 10 species of marine fish

1.2 试剂

无水乙醇、氯仿、异戊醇(分析纯)烟台三和化学试剂有限公司;Tris-平衡酚(pH值8.0)北京索莱宝科技有限公司;10×Buffer缓冲液、Taq DNA聚合酶、dNTPs(2.5 mmol/L)、DNAMarker(DL2000)、100 bp Marker，天根生化科技(北京)有限公司; DH5α感受态细胞，自制;TA克隆试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司;蛋白酶K，德国Merck公司; Goldview核酸染料、普通DNA产物纯化试剂盒、NlaⅢ、HinfⅠ，天根生化科技(北京)有限公司.

1.3 仪器与设备

高速冷冻离心机HC-3018R安徽中科中佳科学仪器有限公司;PCR仪德国Biometra公司;DYCP -31N水平电泳仪北京六一仪器厂;ZF1-Ⅱ紫外分析仪金坛市盛蓝仪器制造有限公司.

1.4 方法

1.4.1 基因组DNA的提取采用常规的酚-氯仿法提取DNA，操作如下:取每尾海鱼保存的背部肌肉组织约150 mg于1.5 mL EP管中，加入200 μL组织提取液(含Tris-HCl 10mmol/L.EDTA 100 mmol/L.SDS 0.5%)，用研杵充分研磨后，补加400 μL组织提取液，10 μL蛋白水解酶K(20 mg/mL)，充分混匀后50℃消化过夜，然后加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25∶24∶1，V/V)，置于冰袋上轻缓颠倒混匀10 min，4℃5 000 g离心6 min.吸取上清液至新的1.5 mL EP管，加等体积氯仿-异戊醇(24∶1，V/V)，置于冰袋上轻缓颠倒混匀20 min，4℃5 000 g离心6 min.吸取上清液至新的1.5 mL EP管中，加入0.1～0.2倍体积2 mol/L的NH4Ac(pH值7.0)，再加入-20℃预冷的无水乙醇，轻轻颠倒混匀，-20℃保存1～4 h.4℃12 000 r/min离心10 min，弃去液体，加入70%乙醇600 μL，轻缓颠倒数次冲洗，4℃12 000 r/min离心5 min，弃去液体，37℃烘箱中烘干，加入100 μL TE溶解DNA，-20℃贮存备用.

1.4.2 通用引物设计从基因库中查找到10种海鱼中除高眼鲽、中间低鳍鲳外(截止2014年10月)的8种海鱼的MT-co3序列，以及其他12种参照海鱼鱼种MT-co3序列.利用DNAMAN软件进行序列比对分析，在MT-co3两端保守区域设计通用引物，通用引物由上海生物工程服务有限公司合成，上游引物F:5’-TAATGGCCCATCAAGCACA-3’，下游引物R:5’-CTTTCCTTGGATTTTAACCAA-3’.

1.4.3 目的DNA片段PCR扩增的反应体系及条件聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)采用25 μL体系，DNA模板1 μL，10×Taq Buffer2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)2.0 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，Taq DNA聚合酶(5 U/ μL)0.15 μL，加ddH2O至25 μL.反应程序为94℃5 min、94℃40 s、53℃50 s、72℃55 s，35个循环，然后72℃10 min.预期扩增片段长度为856 bp.

1.4.4 TA克隆、测序及序列比对对PCR产物用普通DNA产物纯化试剂盒进行纯化，纯化产物与pUCm-T Vector进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，随后涂布在含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基中，37℃培养过夜.挑取8个不同的白色单菌落于含有100 μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃，170 r/min摇床上培养过夜，次日提取质粒，并用M13通用引物扩增，以检测目的基因的存在.PCR检测后，选阳性质粒送上海生物工程服务有限公司进行测序.然后应用NCBI网站的数据库对样品的MT-co3序列进行鉴定以及相似度分析.

1.4.5 PCR-RFLP根据测序结果，利用生物信息软件提供的限制性内切酶酶切信息，筛选经济而实用的酶切组合体系，最终选用NlaⅢ和HinfⅠ2种限制性内切酶对10种海鱼的PCR产物进行酶切分析.酶切体系为15 μl:内切酶(10 000 U/mL)0.3 μL，CutSmart 1.5 μL，PCR产物6 μL，加ddH2O至15 μL，37℃酶切15 min.配制2.0%的琼脂糖凝胶，对酶切结果进行检测.

2 结果与分析

2.1 样本MT-co3序列的扩增与测序

2.1.1 MT-co3序列的扩增结果利用自行设计的通用引物对1～10号海鱼样本的MT-co3序列进行PCR扩增，扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图谱见图1.由图1可知，尽管GenBank数据库中没有高眼鲽、中间低鳍鲳MT-co3的序列，但其仍可被该通用引物所扩增，扩增得到的片段长度约为856 bp，说明自行设计的该引物通用性高.

图1 10种海鱼MT-co3基因的扩增结果Fig.1 MT-co3 gene amplification from 10 species of marine fish

2.1.2 MT-co3测序结果分析每个鱼种选送5个样本，均采用双向测序，对测序结果用NCBI数据库进行相似性检索.检索结果显示，选用MT-co3基因作为分子标记鉴定的鱼种与形态学鉴定的鱼种吻合，均不低于99%(表2)，且实验所得序列均为预期目的片段.该测序结果表明，至少在本研究中，MT-co3基因可用作鉴定不同海鱼种的分子标记.同时获得了高眼鲽、中间低鳍鲳的MT-co3全序列，该序列准备提交数据库.

表2 10种海鱼的形态学鉴定结果及在NCBI数据库的鉴定结果Tab.2 Identification of 10 marine fish species in morphology and the NCBI database

2.2 PCR-RFLP结果及分析

2.2.1 MT-co3扩增片段的酶切结果对10种鱼全部样本测序所得序列结果进行限制性酶切分析显示，各种鱼所选5个样本的NlaⅢ酶切后的片段长度一致;而HinfⅠ酶切后，除小黄鱼、蓝点马鲛和花鲈3种鱼中存在2种不一致的酶切结果外，其余7种鱼所选样本酶切后的片段长度一致.酶切的位点数及酶切产物的片段大小见表3.

表3 2种内切酶在PCR产物上的酶切位点数及消化后的片段长度Tab.3 Restriction pattern of MT-co3 gene after PCR amplification and HinfⅠ/NlaⅢdigestion

此步的酶切实验进行2组，其中小黄鱼、蓝点马鲛和花鲈，从每种鱼的5个平行样本中选择酶切分析有差异的2个样本，其余每种鱼5个平行样本中随机选取2个样本，进行PCR扩增后酶切.限制性酶切琼脂糖凝胶电泳结果见图2(A和B)，酶切图谱显示与序列的酶切分析完全吻合.

图2 10种海鱼MT－co3基因扩增序列的HinfⅠ和NlaⅢ酶切结果Fig.2 Digestion of MT-co3 gene PCR fragment with HinfⅠand NlaⅢrestriction enzymes

2.2.2 酶切结果分析在表2中，部分海鱼MT-co3基因扩增产物经酶消化后有一些小片段，比如经HinfⅠ酶切后小黄鱼产生的72 bp和玉筋鱼产生的45 bp长度的片段、经NlaⅢ酶切后牙鲆产生的97 bp长度的片段等，在图2中并没有出现或是条带较暗，这可能是由于其分子太小，在电场中移动速度比较快，或是目的片段扩增产物条带本身不够亮，酶切后的小分子显色暗或达不到显色的量.另外，图2 NlaⅢ酶切的部分图谱中，虽然PCR产物可以被酶切，但在856 bp处仍显示有1条带(如花鲈)，这归因于没有被内切酶消化完全而残留的PCR产物，可能是由于PCR产物较多，一定量的酶需要较长的时间才能将其消化完全，如果延长酶切时间，可使该处条带消失.

酶切结果之所以出现A、B图式，是因为小黄鱼(列1)、蓝点马鲛(列3)和花鲈(列7)MT-co3基因序列发生了单核苷酸点突变，分别为g.480T→C (小黄鱼)、g.426T→C(蓝点马鲛)、g.498G→C，g. 501T→C，g.750C→A(花鲈)，导致了酶切位点的增加或缺失(图3).从图2和表3中可以看出，HinfⅠ酶切的谱带在小黄鱼、玉筋鱼、鲐鱼、中间低鳍鲳、花鲈和高眼鲽各不相同，许氏平鲉和白姑鱼类似，牙鲆和蓝点马鲛可能会出现类似(图2A);NlaⅢ酶切谱带在牙鲆、蓝点马鲛、高眼鲽和许氏平鲉各不相同，玉筋鱼、鲐鱼、中间低鳍鲳和花鲈类似，小黄鱼和白姑鱼类似.所以单一的HinfⅠ或NlaⅢ酶切都不能将10种海鱼进行区分;尽管小黄鱼、蓝点马鲛和花鲈会出现2种酶切结果，但是依次使用HinfⅠ和NlaⅢ两种酶酶切，仍可以将此10种海鱼进行有效的区分.

图3 序列位点突变导致HinfⅠ酶切位点增加或缺失Fig.3 DNA site mutation causing HinfⅠEnzyme loci increasing or missing

3 讨论

作为用于物种鉴别的基因应具备2个特性，即相对稳定的种内保守性和种间变异性.MT-co1通常被用作DNA barcoding分析和海洋生物类群的群体遗传研究［16］，但深入研究表明其在线粒体的15个主编码基因中最为保守，这在群体遗传研究中可能是不够的［17］.有学者指出，只使用一个线粒体基因作为物种分类的唯一标志物的理念，到目前并没有得到良好的支持［18］.Sperling［19］认为至少有1/4的物种是不容易用DNA Barcoding的方法来区分的.因此，探讨其他线粒体基因用作DNA Barcoding的辅助分子标记具有重要的现实意义.迄今为至，尚未见有以MT-co3基因作为分子标记鉴定海鱼鱼种的相关研究报道，仅有程希婷［20］用MT-co3基因初步探讨海南部分石珊瑚种间、种内遗传距离和分子系统学关系.本研究探讨了MT-co3基因作为分子标记进行鱼类种属的鉴别的实用性.将10种鱼测序得到MT-co3基因序列及每种鱼5个平行样本测序得到的序列分别进行比对分析，结果显示MT -co3基因同样具有种间变异较大、种内较为保守的特征，理论上只要扩增得到待检样品的MT-co3基因，结合适宜的限制性内切酶酶切分析技术，便可对其进行种源性鉴别.

就鱼种的PCR-RFLP技术鉴定而言，要求在保证准确性前提下简捷而实用，利用普通的琼脂糖凝胶电泳即可清楚展示每种鱼检材的特异性谱带.本研究选用HinfⅠ和NlaⅢ2种酶的组合，内切酶种类少，但其琼脂糖凝胶电泳酶切图谱所含信息量大，足以揭示所研究的各鱼种种源性.实验过程1 d即可完成，操作简单，成本较低，在普通分子生物学实验室条件下即可开展此项工作.

需要提及，由于动物体内的线粒体DNA不发生遗传重组，因此与细胞核DNA相比有较高的突变率，不同个体间可能偶见一定的变异发生，导致同一鱼种内出现异样的酶切谱带.在本研究的10种海鱼中，小黄鱼、蓝点马鲛和花鲈由于种内MT-co3基因碱基发生突变，导致检测不出或产生额外的限制性酶切位点(集中发生在HinfⅠ酶切位点).因此，实践应用时可考虑选择线粒体其它基因，比如MT -co1、cyt b、16S rRNA等分子标记进行分析鉴定;另一种策略是筛选其他适宜的限制性酶进行酶切分析，这部分工作有待进一步研究.

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Identification of Fish Species for Yantai Seafood Market based on Mitochondria DNA Polymorphism

YU Wei-xia1，LIU Xiao-ling1，WANG Min-qiang1，ZHAO Ming-ri1;WANG Jia-xuan2
(1.School of Life Science，Yantai University，Yantai 264005，China;2.College of Life Science，Shandong Normal University，Jinan，250014，China)

The PCR-based restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)is used to identify 10 marine fish species(Larimichthys polyactis，Paralichthys olivaceus，Scomberomorus niphonius，Ammodytes personatus，Scomber japonicus，Peprilus medius，Lateolabrax japonicus，Cleisthenes herzensteini，Sebates schlegeli，Pennahia argentata，)with relatively important commercial value，which are randomly sampled from Yantai seafood market.The genomic DNAs of the 10 species of marine fish are extracted，and the mitochondria cytochrome c oxidase subunitⅢgene (MT-co3)of all samples are amplified with a pair of self-designed universal primers.The PCR products are then cloned and sequenced.RFLP analysis is carried out based on the sequencing result using two restriction enzymes，NlaⅢand HinfⅠ，to digest the PCR products.A specific-restriction map for each fish species is obtained through the PCR-RFLP method.The results show that the PCR-RFLP is a simple and accurate method that can effectively distinguish the 10 selected fish species.This method may provide scientific basis for fish food source testing.

polymerase chain reaction-based restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP);species identification;cytochrome coxidase subunitⅢgene of mitochondrion DNA(MT-co3);marine fish

Q31

A

(责任编辑 周雪莹)

1004-8820(2015)02-0097-06

10.13951/j.cnki.37-1213/n.2015.02.004

2014-11-01

山东省自然科学基金资助项目(ZR2013CQ021).

于卫霞(1984-)，女，山东临沂人，硕士研究生.

王敏强(wangmqytu@163.com)，教授，博士，研究方向:生物化学与分子生物学.