硫化氢减轻吗啡依赖大鼠戒断症状的机制

秦 伟 金 寰 罗孝美 陈远寿

(遵义医学院生理学教研室，贵州 遵义 563000)

硫化氢减轻吗啡依赖大鼠戒断症状的机制

秦 伟 金 寰 罗孝美 陈远寿

(遵义医学院生理学教研室，贵州 遵义 563000)

目的 观察硫化氢(H2S)对吗啡依赖大鼠戒断症状、体质量、一氧化氮(NO)含量以及一氧化氮合酶(NOS)活性的影响，探讨H2S减轻吗啡依赖大鼠戒断症状的机制。方法 将40只雄性SD大鼠随机分为对照组、吗啡依赖组、硫氢化钠(NaHS)组和羟胺(HA)组。吗啡依赖组按剂量递增原则皮下注射吗啡，NaHS组和HA组分别于注射吗啡前30 min腹腔注射NaHS和HA，对照组注射等量生理盐水。纳洛酮诱发戒断症状确定模型成功建立，然后观察四组大鼠戒断症状和体质量变化，比色法测定大鼠血浆及海马组织NO含量，Real time PCR测定海马组织nNOS mRNA表达量。结果 吗啡依赖组和HA组与对照组比较，戒断症状积分升高(P<0.05)，体质量下降(P<0.05)，血浆和海马组织NO含量以及NOS活性升高(P<0.05)；NaHS组与依赖组相比，戒断症状积分降低(P<0.05)，体质量增加(P<0.05)，NO含量以及NOS活性下降(P<0.05)而NaHS组与对照组比较，戒断症状、体质量、NO含量以及NOS活性均无显著差异(P>0.05)。结论 外源性H2S可减轻吗啡依赖大鼠戒断症状，控制吗啡依赖大鼠体质量的下降，其作用机制可能与外源性H2S抑制NO的产生、下调nNOS mRNA表达有关。

硫化氢；吗啡依赖；戒断症状；体质量；一氧化氮/一氧化氮合酶

长期应用阿片类药物会使机体产生躯体性和精神性依赖，一旦突然停药，机体将产生流汗、颤抖、发热、血压升高、肌肉疼痛和痉挛等一系列生理功能紊乱，即戒断综合征〔1〕。目前临床上主要采用脱毒治疗，但是其复吸率却高达95%。因此，研究药物依赖的发生机制和寻找治疗药物依赖的新途径有着重要的理论意义和社会意义。目前研究认为，H2S在神经、心血管以及免疫系统等方面均发挥着重要作用，尤其是在中枢神经系统疾病中能有效减缓缺血性脑梗死、阿尔茨海默病、热惊厥、帕金森病的发生发展〔2，3〕。近年有研究报道，外源性硫氢化钠(NaHS)可减轻海洛因成瘾大鼠戒断症状，提高大鼠伏隔核H2S水平，而海洛因会降低大鼠伏隔核H2S水平〔4〕，课题组最近的研究也观察到外源性H2S可减轻大鼠学习记忆减退及神经元损伤，提示H2S具有抗阿片类物质依赖作用，但其作用机制有待进一步研究。阿片类物质依赖的机制十分复杂，可能涉及体内多种神经递质或调质，如去甲肾上腺素、多巴胺、一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)等多种因素。因此，该研究通过建立吗啡依赖大鼠模型，采用比色分析法和Real time PCR技术，结合吗啡依赖大鼠戒断实验，观察H2S对吗啡依赖大鼠戒断症状的影响以及NO/NOS变化。

1 材料与方法

1.1 动物分组 清洁级雄性SD大鼠(由重庆第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供)40只，体重为180～220 g。随机分为对照组(生理盐水)、依赖组(吗啡依赖大鼠)、NaHS组(吗啡依赖大鼠+NaHS)、羟胺(HA)组(吗啡依赖大鼠+HA)，每组10只。

1.2 实验试剂 盐酸吗啡(沈阳第一制药厂)；盐酸纳洛酮注射液(益侨湖南制药有限公司)；NaHS与HA(购自美国Sigma公司)；NO测定试剂盒(南京建成生物工程研究所)；nNOS mRNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR试剂盒(日本TaKaRa生物工程公司)。根据GenBank查出nNOS和β-actin的引物序列，nNOS上游5′CCTATGCCAAGACCCTGTGTGA3′，下游3′CATTGCCAAAGGTGCTGGTG5′，产物长度132 bp；β-actin上游5′GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA3′，下游3′GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG5′，产物长度150 bp。

1.3 仪器设备 Eppendof Mastercycler Gradient PCR仪由德国Eppendorf 公司生产，Icycler 荧光定量PCR仪由美国BIO-RAD 公司生产，Tu-1810 紫外分光光度计由北京通用分析仪器公司生产。

1.4 方法

1.4.1 建模 按逐日递增的原则，采用皮下注射盐酸吗啡复制吗啡依赖大鼠模型，以同样方法给予等量生理盐水建立对照组模型，第10天给予5 mg/kg纳洛酮皮下注射诱发戒断症状，参照柳田知司标准进行戒断评分〔5〕，确定吗啡依赖大鼠模型是否成功建立。第10～12天，每天按50 mg/kg注射一次吗啡维持依赖大鼠模型。NaHS组和HA组分别于注射吗啡前30 min给予腹腔注射NaHS(14 μmol/kg)和HA(12.5 mg/kg)。

1.4.2 戒断症状及体重观察 各组大鼠分别于戒断前和戒断后60 min称重，并计算体重变化值。戒断症状的观察参照柳田知司评分标准，分别记录可数和不可数症状，可数症状包括大鼠齿颤、扭体﹑站立﹑湿狗样抖﹑伸展﹑清理皮毛等，分别记录各自出现的次数不可数症状为上睑下垂，每2分钟评定一次。以上症状观察30 min，全部症状得分之和为戒断评分。

1.4.3 NO含量测定 各组大鼠戒断症状评分结束后，35%水合氯醛(1 ml/kg)麻醉，断头取血，剥离出完整海马冻存。血浆NO的测定采用硝酸还原酶法。海马NO的测定，首先将冻存海马组织取出后匀浆，低温低速离心10 min(3 000 r/min)，取离心好的匀浆上清液分别测定总蛋白含量和NO含量，参照考马斯亮蓝蛋白试剂盒和NO测试盒说明书操作。

1.4.4 nNOS mRNA表达的检测 取出冻存液中的海马组织，采用Real-time PCR方法提取组织中总RNA，并检测RNA的纯度和浓度。实验中RNA纯化、纯度和含量测定、逆转录及扩增步骤按试剂盒说明书进行操作。目的基因的相对定量方法采取以PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数(Ct值)进行统计。

1.5 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件包进行单因素方差分析，运用S-N-K法进行组间比较。

2 结 果

2.1 H2S对吗啡依赖大鼠戒断症状及体重的影响 纳洛酮诱发戒断症状发现，吗啡依赖组、HA组大鼠均出现湿狗样抖、伸展、扭体、理毛、齿颤以及直立等症状，戒断症状分值明显高于对照组(P<0.05)，表明成功建立吗啡依赖大鼠模型。而NaHS组的戒断症状分值低于吗啡依赖组(P<0.05)，NaHS组与对照组比较无显著差异(P>0.05)。纳洛酮催促后60 min，吗啡依赖组和HA组体重变化明显高于对照组(P<0.05)，NaHS组的体重变化低于吗啡依赖组(P<0.05)，NaHS组与对照组比较无显著差异(P>0.05)。见表1。

2.2 H2S对吗啡依赖大鼠血浆及海马组织NO含量的影响 与对照组比较，吗啡依赖组、HA组大鼠血浆和海马组织NO含量显著增高(P<0.05)，而NaHS组大鼠血浆和海马组织NO含量低于吗啡依赖组(P<0.05)，NaHS组与对照组比较无显著差异(P>0.05)。见表2。

2.3 H2S对吗啡依赖大鼠海马组织nNOS mRNA表达的影响 吗啡依赖组、HA组大鼠海马组织的nNOS mRNA表达吗啡(1.82±0.34、1.88±0.45)较对照组增加(0.88±0.17，P<0.05)，NaHS组的nNOS mRNA表达(0.96±0.27)低于吗啡依赖组(P<0.05)，而NaHS组与对照组比较无显著差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠戒断症状评分和体重变化比较±s)

与对照组比较：1)P<0.05；与吗啡依赖组比较:2)P<0.05，下表同

表2 各组大鼠血浆及海马组织NO含量比较

3 讨 论

而近年来人们发现H2S在机体内广泛存在，具有重要的细胞保护作用。最近的研究表明，使用H2S的海洛因成瘾大鼠戒断症状明显低于单独使用海洛因组大鼠，外源性NaHS可以抑制腺苷酸环化酶/cAMP途径，影响海洛因依赖大鼠伏隔核cAMP信号通路〔6〕，提示H2S及其同系物对吗啡依赖有积极作用，有望开发成为一种新型的防治阿片类物质依赖的药物，但其作用机制及应用前景尚有待于进一步研究和证实。

课题组先前的研究发现外源性硫氢化钠可提高吗啡依赖大鼠血浆H2S含量，降低伏核和海马cAMP含量，减轻吗啡依赖大鼠学习记忆减退及海马神经元损伤〔7～9〕。近年来的研究也发现H2S作为一种神经调节因子，能有效缓解神经系统疾病的发生发展，并能减轻相应临床症状。本研究结果提示外源性H2S可减轻吗啡依赖大鼠戒断症状及体质量变化，由此推测将H2S或者同系物开发成为一种新型的防治阿片类物质依赖的药物成为可能。

近年来，已经证实NO在中枢神经系统中起着细胞间信息传导的作用，能够介导许多生理和病理过程，其中包括参与吗啡的耐受和依赖过程。在对阿片类物质滥用的研究中证实，阿片滥用者血清NO含量高于普通人群，因此有研究者认为NO可能介导了阿片类物质依赖和耐受的形成〔10〕。NOS作为NO生物合成的关键酶，不同的NOS催化合成的NO在不同的组织细胞中发挥着不同的生物学效应。以往实验研究表明，中枢神经系统内的NO在吗啡依赖和戒断的形成中通过NMDA/NO/cGMP信号转导通路产生效应，其中神经元型NO合酶(nNOS)的活性直接影响此通路中NO的合成〔11〕，提示中枢内NO和nNOS在吗啡依赖和戒断的形成中可能发挥重要作用。本研究发现吗啡依赖大鼠血浆和海马组织NO含量显著增高，海马组织的nNOS mRNA表达增加，这与以往文献报道的结果是一致的。然而给予外源性H2S供体NaHS后，大鼠血浆和海马组织NO含量以及海马nNOS mRNA表达均低于吗啡依赖组。由此推测，H2S减轻吗啡依赖大鼠戒断症状的原因，可能是由于H2S抑制了以上基因的表达，当然也有可能是与其他因素相互作用的结果。

1 Jiang H，Han Y，Du J，etal.Factors associated with one year retention to methadone maintenance treatment program among patients with heroin dependence in China〔J〕.Subst Abuse Treat Prev Policy，2014；9(1)：11-5.

2 Li FH，Ming L，Tsun P，etal.Hydrogen sulfide：neurophysiology and nourothology〔J〕.Antioxid Redox Signal，2011；15(2)：405-19.

3 Russo CD，Tringali G，Ragazzoni E，etal.Evidence that hydrogen sulfide can modulate hypothalamo-pituitary-adrenal axis function：in vitro and in vivo studies in the rat〔J〕.J Neuroendocrinol，2000；12(3)：225-33.

4 Jiang LH，Wang J，Wei XL，etal.Exogenous sodium hydrosulfide can attenuate naloxone-precipitated withdrawal syndromes and affect cAMP signaing pathway in heroin-dependent rat′s nucleus accumbens〔J〕.Eur Rev Med Pharmacol Sci，2012；16(14)：1974-82.

5 张均田.现代药理实验方法(上册)〔M〕.北京:中国协和医科大学,北京医科大学联合出版社，1998：1073-81.

6 Yang HY，Wu ZY，Wood M，etal.Hydrogen sulfide Attenuates opioid dependence by suppression of adenylate cyclase/cAMP pathway〔J〕.Antioxid Redox Signal,2014；20(1)： 31-41.

7 秦 伟，刘晓红，肖顺武.新型气体信号分子H2S对吗啡依赖大鼠伏核和海马cAMP水平研究〔J〕.中国现代医学杂志，2009；19(17)：2623-5.

8 秦 伟，金 寰，罗孝美，等.硫化氢对吗啡依赖大鼠空间学习记忆及海马NMDA受体表达的影响〔J〕.遵义医学院学报，2011；34(5)：453-6.

9 秦 伟，金 寰，罗孝美，等.硫化氢对吗啡依赖大鼠学习记忆的影响及机制研究〔J〕.中国现代医学杂志，2014；24(26)：18-21.

10 魏 洁，张引国，李积胜.吗啡条件性位置偏爱与海马一氧化氮合酶的关系〔J〕.中国行为医学科学，2005；14(5):394-5.

11 秦承伟，张励才，曾因明.毁损大鼠中缝背核内触液神经元对吗啡依赖和戒断的影响〔J〕.中国应用生理学杂志，2007；23(3)：286-91.

〔2015-03-13修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

贵州省科技厅社会发展攻关项目(No.20083066)；贵州省卫生厅项目(No.gzwkj2013-1-013)；遵义医学院重点学科建设项目(No.XZXK-20120702)

秦 伟(1976-)，男，副教授，硕士，主要从事阿片成瘾及神经疾病的研究。

R915；Q423

A

1005-9202(2015)12-3235-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.021